麻黄细辛附子汤6种活性成分提取动态变化研究

马学梅，李凌军，谢慧超，高爽，王玉真，容蓉，杨勇

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

麻黄细辛附子汤[1]出自东汉张仲景的《伤寒论》，具有扶正解表、温经解表之功效。麻黄发汗散寒，细辛解表散寒，附子补火助阳，三药合煎共治阳虚外感之症[2]。近年来，临床上有研究报道称使用该方的三味药引起中毒和不良反应，煎煮不当是其中的一个重要原因[3]。中医临床上常采用久煎的手段来降低附子乌头碱毒性，但长时间煎煮药理活性也逐渐减弱或消失[4-6]，细辛脂素水煎液溶出量低[7]也对全方提取带来困难。因此，全方煎煮时间的控制是建立规范化煎煮工艺的关键。

本实验目的在于研究麻黄细辛附子汤全方水提工艺麻黄中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛中的细辛脂素以及附子中的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的提取含量动态变化，为提取工艺的设计及优化提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Technologies 1260 Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；KQ-250E型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；BS110S分析天平(北京赛多利斯公司)；New Classic MC 十万分之一电子天平(梅特勒-托利多公司)；IKA RV8旋转蒸发仪(艾卡(广州)仪器设备有限公司)；FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 材料

本实验所使用的麻黄(批号：130315)购自泰山中药有限公司；细辛(批号：16050202)购自安徽协和成药业饮片有限公司；黑顺片(批号：151008)购自四川江油中坝附子科技发展有限公司。经山东中医药大学李峰教授鉴定，麻黄为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf.的干燥草质茎；细辛为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFi.Schmidt var.mandshuricumKittag.的干燥根及根茎；黑顺片为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，按照《中国药典》2015年版[8]相关项下要求检查均符合规定。

盐酸麻黄碱(纯度99.8%，批号：171241-201508)、盐酸伪麻黄碱(纯度99.8%，批号：171237-201509)、苯甲酰新乌头原碱(纯度96.3%，批号：111795-201303)、苯甲酰乌头原碱(纯度97.5%，批号：111794-201304)、苯甲酰次乌头原碱(纯度94.6%，批号：111796-201304)均购自中国食品药品检定研究所；细辛脂素(纯度98%，批号：Z21D6B7491)购自上海源叶生物科技有限公司。

水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同提取时间煎液的制备

分别称取麻黄25 g，细辛25 g，黑顺片50 g各6份，粉碎为最粗粉，加10倍量水浸泡30 min，分别以20、40、60、90、120、150 min为提取时间节点。药液经2层纱布滤过，分别减压浓缩至l mL药液含1 g复方饮片，标记备用。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的制备

分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品适量，加甲醇制备成浓度分别为0.540 0、0.410 0 mg·mL-1的对照品储备溶液。分别精密移取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱储备液置于同一50 mL容量瓶，甲醇稀释至刻度，得浓度0.108 0、0.082 0 mg·mL-1的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品储备液Ⅰ。

精密称取细辛脂素对照品适量，置50 mL容量瓶，乙腈稀释至刻度，得浓度0.235 0 mg·mL-1的细辛脂素对照品储备液。

分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，加甲醇制备成浓度分别为0.222 3、0.219 0、0.217 7 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密移取对照品储备液置同一10 mL容量瓶，甲醇稀释至刻度，得浓度0.066 7、0.065 7、0.065 3 mg·mL-1的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱混合对照品储备液Ⅱ。

2.2.2 供试品溶液制备

分别精密移取2.1项下各组浓缩液适量，蒸干后用1.44%磷酸水溶液制备成0.012 g·mL-1的供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的供试品溶液a1～6。

分别精密移取2.1项下各组浓缩液适量，蒸干后用70%甲醇制备成0.6 g·mL-1的供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，作为细辛脂素的供试品溶液b1～6。

2.3 色谱条件

2.3.1 测定麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的色谱条件

Ultimate Phenyl-Ether 2901.07(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相A为甲醇，B为0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺)，检测波长210 nm，流速1 mL·min-1,柱温30 ℃，盐酸麻黄碱的保留时间为8 min，盐酸伪麻黄碱的保留时间为10 min，相关色谱峰见图1～2。

图1 混合对照品储备液Ⅰ色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances I

图2 供试品溶液a1色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of sample a1

2.3.2 测定细辛中细辛脂素的色谱条件

Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱；流动相A为乙腈，B为纯水，等度洗脱，检测波长287 nm，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃，细辛脂素的保留时间为24.00 min，相关色谱峰见图3～4。

图3 细辛脂素对照品储备液色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of reference substances of asarinin

图4 供试品溶液b1色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of sample b1

2.3.3 测定附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的色谱条件

1苯甲酰新乌头原碱；2 苯甲酰乌头原碱；3 苯甲酰次乌头原碱图5 混合对照品储备液Ⅱ色谱图Fig.5 HPLC Chromatogram of reference substancesⅡ

1苯甲酰新乌头原碱；2 苯甲酰乌头原碱；3 苯甲酰次乌头原碱图6 供试品溶液c1色谱图Fig.6 HPLC Chromatogram of sample c1

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围

精密移取2.2.1项下制备的混合对照品储备液Ⅰ，制备成浓度分别为0.091 8/0.069 7、0.075 6/0.057 4、0.059 4/0.045 1、0.043 2/0.032 8、0.027 0/0.020 5、0.010 8/0.008 2 mg·mL-1的盐酸麻黄碱/盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液。

精密移取2.2.1项下制备的细辛脂素对照品储备液，制备成浓度分别为0.235 0、0.199 8、0.164 5、0.129 3、0.094 0、0.058 9 mg·mL-1的细辛脂素对照品溶液。

精密移取2.2.1项下制备的混合对照品储备液Ⅱ，制备成浓度分别为0.066 7/0.065 7/0.065 3、0.053 3/0.052 5/0.052 3、0.040 0/0.039 4/0.039 2、0.026 7/0.026 3/0.026 1、0.013 3/0.013 1/0.013 1、0.003 3/0.003 3/0.003 3 mg·mL-1的苯甲酰新乌头原碱/苯甲酰乌头原碱/苯甲酰次乌头原碱混合对照品溶液。

进样20.00 μL测定，记录峰面积。分别以各成分峰面积为纵坐标y，以对照品溶液浓度为横坐标x，得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱回归方程，分别为y1=46 423x-2.970 5,r=0.999 9,n=6;y2=50 483x+10.722,r=0.999 9,n=6;y3=26 017x+91.474,r=0.999 7,n=6;y4=20609x+15.538,r=0.999 8,n=6;y5=26 475x+15.012,r=0.999 7,n=6;y6=20 544x+2.134 8,r=0.999 9,n=6。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱线性范围分别为0.216 0～1.836 0 μg、0.164 0～1.394 0 μg、1.175 0～4.700 0 μg、0.066 7～1.333 4 μg、0.065 7～1.313 2 μg、0.066 5～1.306 6 μg。

2.4.2 精密度实验

精密移取2.2.1项下制备的混合对照品Ⅰ、细辛脂素对照品、混合对照品Ⅱ稀溶液，分别按照2.3.1、2.3.2、2.3.3项下色谱条件连续进样6次，测定得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的相对标准偏差(n=6)分别为0.60%、0.24%、0.26%、2.45%、2.26%、1.89%，表明该仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

精密移取2.2.2项下制备的供试品溶液，按2.3.1、2.3.2、2.3.3项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定。测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的相对标准偏差(n=6)分别为0.60%、1.52%、0.73%、1.19%、2.70%、0.67%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性实验

精密移取2.1项下制备的溶液，分别按照2.2.2项下的制备方法制备供试品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱含量的相对标准偏差(n=6)分别为0.14%、0.05%、1.65%、2.35%、2.41%、2.36%，表明方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收实验

精密移取2.1项下已知含量的同一供试品溶液18份，分成3组，分别精密加入2.2.1项下制备的混合对照品储备液Ⅰ、细辛脂素对照品溶液、混合对照品储备液Ⅱ适量，再按照2.2.2项下的制备方法制备供试品溶液。分别按照2.3.1、2.3.2、2.3.3项下色谱条件测定，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的平均回收率(n=6)分别为99.05%、97.01%、98.55%、103.71%、97.61%、102.98%，表明该方法稳定可靠。

2.5 样品含量测定

精密移取2.1项下制备的各组溶液，分别按照2.2.2项下的制备方法制备供试品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3项下色谱条件进样分析，计算每克生药中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、细辛脂素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量，结果见表1。

表1 不同煎煮时间活性成分含量测定结果Table 1 Determination results of active ingredients in different decocting time

2.6 数据分析

应用SPSS 17.0 软件对实验数据进行统计学分析，采用方差分析中双因素分析法对各成分不同提取时间溶出量进行分析。分析结果显示，F=2.773，P<0.05，有统计学意义，可认为各成分在各煎煮时间点溶出量有显著性差异。

按照《中国药典》[8]项下要求对药材进行含量测定，根据转移率%=供试品含量/药材含量，对实验数据进行计算，得各药材的转移率，见图7 。

图7 麻黄生物碱、细辛脂素、附子单酯型生物碱转移率曲线图Fig.7 Transfer curves of ephedrine alkaloids, asarone and monactone alkaloids

对于麻黄中的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱来说，转移率的拐点在90 min达到91.65%。20 min时转移了76.00%，是因为煎煮时间较短，有效成分溶出量相对较少；然后在20～90 min之前转移率逐步上升，90～120 min转移率上升趋势较缓。120 min之后溶出量反而有所下降。

细辛中细辛脂素转移率的拐点也在90 min，为23.47%。在提取前20 min细辛脂素转移率仅达11.36%，然后在20～90 min之间转移率逐步上升，到90 min时，溶出量达最大。90 min后，细辛脂素溶出总量开始降低。90～120 min细辛脂素总量减少速度较快，120～150 min消减速度有所减慢，但仍是消减趋势。

附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总溶出量在20 min时转移率达到70.03%，在20～90 min附子单酯型生物碱的溶出量在缓慢上升，转移率最高达77.03%，之后开始下降。

3 结论与讨论

中药传统汤剂在煎煮过程中，煎煮时间的长短对煎液的质量有非常重要的影响[9]，选择合适的煎煮时间对提高药物的临床疗效有现实意义。药材中有些成分相互之间或与细胞壁之间，存在一定的亲和性而有相互吸附的作用。溶剂进入药材要先解除吸附，才能使有效成分分散于溶剂中。有效成分不断溶出使细胞内外出现浓度差和渗透压差，促使有效成分溶出。煎煮时间太短，有效成分溶出不完全；反之，长时间煎煮可能会导致大量杂质溶出，某些有效成分分解或者转化，含量减少。因此，要根据药物的质地、有效成分性质等因素选择合适的煎煮时间[10]。

附子水煎液中生物碱含量低，成分复杂，测定方法[11-13]常有相邻峰和“假阳性峰”的干扰。在固相萃取中，固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时，附子生物碱浓缩在其表面，其他样品成分通过吸附剂床。通过只吸附生物碱而不吸附其他样品成分的吸附剂，可以得到高纯度和浓缩的附子生物碱。采用阳离子交换固相萃取柱对附子煎液进行富集和精制[14]，获得了理想的效果，各成分达到基线分离，提高了测定方法的适用性和准确度。

麻黄中的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为仲胺生物碱，碱性较强。由于伪麻黄碱的共轭酸会形成分子内氢键，稳定性大于麻黄碱，所以伪麻黄碱的碱性强于麻黄碱。二者的分子较小，既可溶于水，又可溶于氯仿，但伪麻黄碱在水中的溶解度较麻黄碱小，本实验测定结果也是盐酸麻黄碱先于盐酸伪麻黄碱出峰，与文献报道[15]一致。在煎煮过程中，随着时间变化二者溶出量的比值(相对标准偏差1.42%,n=6)可认为差异不显著。麻黄碱类90 min时转移率已经达到91.65%，溶出量高。

细辛脂素呈游离型，偏亲脂性，难溶于水，所以其在水里的溶解度是有限的，而浓度梯度对提取有显著影响。因此，当细辛脂素达到溶解平衡后，由于浓度梯度达到动态平衡，增加提取时间不能提高提取率。有文献报道[16]，在中药复方水煎液中细辛脂素含量和单味药水煎液的含量存在显著性差异。这说明复方配伍能够通过增溶原理增加细辛脂素的溶解度。考虑在后期提取中，细辛可以通过增加煎煮次数来提高细辛脂素的溶出量。

附子单酯型生物碱含量随着煎煮时间延长先增后降，这与其他报道[17]相吻合。一般报道称附子双酯型生物碱是毒效成分[18]，为了进一步了解附子各生物碱的转化情况可对双酯型生物碱做进一步考察。

以上数据及曲线有不规则的地方，除了实验误差外，认为还有中药煎煮过程中各种复杂成分相互交错影响的原因[19-21]，但是并不影响从中得出趋势。本方中三味药在煎煮20 min时有效成分溶出明显低于其他煎煮时间，然后在90 min时有明显增加，之后出现缓慢增长，120 min后出现消减现象。说明久煎并不能使有效成分绝对增加，长时间加热会使有些成分发生分解或者转化，具体转化情况有待进一步研究分析。通过本实验得出麻黄细辛附子汤合煎90 min时6种活性成分稳定存在，同时也使溶出量达到峰值。此外，药材粒度与加水量对有效物质提取的影响亦较大，为进一步增加有效成分溶出总量及提高溶出速度，下一步可对药材粒度、加水量进行考察。