杨梅叶中花色苷提取工艺优化

金 茜，赵 特，胡明华

(遵义师范学院，贵州遵义 563006)

花色苷是目前清除氧自由基和脂质过氧化的抑制剂之一[1-9]，是一种天然色素，在欧美等国家已广泛应用于医药和保健食品行业[10-11]。提取花色苷的方法有双水相法、超声波法、微波法、酶解法等[12-14]等。本试验以恒温水浴震荡器为辅助仪器，采用溶剂提取法进行花色苷的提取，为杨梅叶资源综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：SHIMADZU AUX220 电子天平，日本岛津；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂制造；SHA-B恒温水浴震荡器，金坛市科析仪器有限公司；FW135中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；ZK-82B真空干燥箱，天津天有利科技有限公司；pHS-3C型精密算度计，上海大普仪器有限公司。

试剂：无水乙醇(AR)、混合磷酸盐缓冲溶液(pH=6.86)、氯化钾(AR)、浓盐酸(AR)、乙酸钠(AR)、pH1.0氯化钾缓冲溶液、pH4.5乙酸钠缓冲溶液，所有试剂均购自成都试剂厂。

1.2 材料

杨梅叶，2016年6月—2017年1月采摘于遵义，洗净后晾干或低温烘干，粉碎，避光保存。

1.3 杨梅叶中花色苷的提取方法

准确称取一定量的杨梅叶粉末，以80%的乙醇为提取剂，盐酸质量分数为0.3%，在60℃的恒温水浴震荡器里浸提60min，于5 000r/min离心10min。

1.4 花色苷最大吸收光谱的测定

提取液用紫外可见分光光度计进行光谱扫描，测定杨梅叶中花色苷的最大吸收波长。由图1可知，杨梅叶花色苷在520～550nm之间有明显的吸收峰，在538nm处有最大吸收，故其最大吸收波长为538nm。

图1 杨梅叶花色苷特征吸收光谱

1.5 pH示差法测定花色苷含量

在不同的pH条件下，花色苷会表现出不同的结构，当pH=1.0时，花色苷以有色的黄烊盐正离子的形式存在；当pH=4.5时，则以无色半酮缩醛形式存在。两种物质的吸光度有很大差别，但结构都相对稳定，故可用pH示差法测定花色苷的含量[15]。各取上清液1mL，分别加入氯化钾缓冲溶液(pH1.0)和醋酸钠缓冲溶液(pH 4.5)各9mL，混合后平衡1h，用乙醇溶液作空白，在最大吸收波长λmax和700nm(校正浑浊度)处测得稀释后样品的吸光值。根据式(1)、(2)计算花色苷的含量。

花色苷浓度(mg/L)=[(Aλmax-Aλ700)pH 1.0-(Aλmax-Aλ700)pH 4.5]×Mw×DF×1 000/k

(1)

式(1)中，Mw—相对分子质量；DF—样品稀释倍数；k—摩尔吸光系数。当k未知或样品成分未知时，将矢车菊-3-葡萄糖苷作为标准物，此时Mw=449.2，k=26 900。

花色苷含量m(mg/g，DW)=C×V/m0

(2)

式(2)中，DW—样品为干重状态；V—浸提液体积；m0—样品干重时的质量。

2 单因素试验与分析

2.1 乙醇浓度的选择及对花色苷提取率的影响

由图2可知，花色苷的提取率随乙醇浓度的变化而改变，当乙醇浓度为80%时，花色苷提取率最高。

表1 花色苷提取率随乙醇含量的变化

图2 乙醇含量对花色苷提取量的影响

2.2 提取时间对花色苷提取率的影响

由图3可知，当提取时间为60min时，花色苷的提取率达到最大，随后花色苷的提取量下降。随着提取时间的延长导致了其他成分含量的增加，且提取率下降，同时延长了试验的时间，因此选取60min作为提取的最佳时间。

图3 提取时间对花色苷提取量的影响

表2 花色苷提取率随时间的变化

2.3 提取温度对花色苷提取率的影响

由图4可知，当温度不断升高，杨梅叶中花色苷的提取率不断上升，当提取温度达到60℃时提取率达到最大，并随温度的升高而急剧下降，与文献[16]结果一致，可能是花色苷的结构在较高的温度环境下受到了破坏，因此提取花色苷的温度应控制在60℃左右。

表3 花色苷提取率随提取温暖的变化

图4 提取温度对花色苷提取量的影响

2.4 料液比对花色苷提取率的影响

由图5可知，随着料液比的增加花色苷的提取率不断上升，当料液比为1∶70时，花色苷的提取率趋于稳定，因此选取的料液比为1∶70。

表4 花色苷提取率随料液比的变化

图5 料液比对花色苷提取量的影响

2.5 最佳盐酸浓度对花色苷提取率的影响

由图6可知，当盐酸浓度为0.3%时，花色苷的提取率达到最大，当酸度过高时花色苷的提取率反而下降，可能是花色苷中的糖苷键水解导致色苷提取率下降[17]。因此试验时选取0.3%的盐酸浓度。

表5 花色苷提取率随盐酸浓度的变化

图6 盐酸体积分数对花色苷提取量的影响

2.6 最佳提取次数对花色苷提取率的影响

由图7可知，当提取次数为1时，杨梅叶中花色苷的提取率最高，因此提取次数为1。

表6 花色苷提取率随提取次数的变化

图7 提取次数对花色苷提取量的影响

3 花色苷提取的多因素正交试验

按照四因素三水平进行正交试验L9(34)，对浸取时间、浸提温度、乙醇含量、料液比4个因素进行优选(表7、表8)。由极差(R)分析知，料液比对杨梅叶中花色苷的提取影响较大，其次是提取温度和提取时间，影响最小的是提取剂浓度，即A>D>C>B，比较综合各因素的 K 值，最佳提取工艺为料液比为1∶70、乙醇含量为80%、温度为60℃、提取时间为60min，此条件下的提取率最高。

表7 正交试验因素水平

表8 正交试验结果

4 结论

杨梅叶花色苷最佳提取工艺为料液比为1∶70、乙醇含量为80%、温度为60℃、提取时间为60min，此条件下的提取率最高。该提取方法操作简单、方便、无污染。从杨梅叶中提取的花色苷粗产品可进一步纯化，用于饮料、食品及医药中，为充分利用杨梅叶资源提供了参考依据。◇