蛋白鲜味肽复合调味品生产技术研究

王 虹，刘 鑫，邹晓霜，李佳妮，王 欢，齐宝坤，王中江，江连洲

(1黑龙江珍选食品有限公司，哈尔滨 150060；2东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

风味肽具有加工性良好、易被消化吸收，并兼具有某些特定生理活性等诸多优点，其中鲜味肽在保有其他味觉条件不被破坏的情况下，还可提升各自的呈味风味，所以鲜味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[1-3]。目前，我国研制的复合调料存在食用品质差、风味失真等缺陷[4]。本试验利用定向分段酶解技术酶解鲜味原料底物，即沙丁鱼及对虾[5]，经前阶段试验已探究出复合蛋白酶初步酶解最优工艺，即复合蛋白酶加酶量3.3%、温度57℃、酶解时间3.5h、pH7.1，将蛋白较充分地水解成肽片段，结构更为松散后，再加入风味复合酶实现第二阶段的酶解[6]，如此可在保证传统鲜味的同时，提高蛋白质得率，便于人体吸收。采用单因素试验及响应面法，以优化风味蛋白酶添加量、酶解时间、温度及pH等工艺，最终确定定向分段酶解条件，并以对虾及沙丁鱼水解液为原料与其他调味原料复配，开发新型海鲜调味料[7]，为研发新型高鲜、高香以及高营养特性的海鲜复合调味品开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1材料 对虾、沙丁鱼，市售；复合蛋白酶，诺维信(中国)投资有限公司；浓硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基红、溴甲酚绿，上海凌峰化学试剂有限公司；酶解液、葡萄糖、白砂糖、食盐、酱油、海藻酸钠、淀粉、生姜粉，均为食品级。

1.1.2仪器与设备 Mettler Toledo分析天平，上海衡平有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，上海一恒有限公司；F-4500型荧光分光光度计，日本Hitachi公司；GL-25MS 超速高速冷冻离心机，上海盛析仪器设备有限公司；超滤装置，无锡赛普膜科技发展有限公司；KND2C型定氮仪，上海纤捡仪器有限公司；数显台式酸度计，上海浦春计量仪器有限公司；旋转蒸发干燥仪，上海亚荣有限公司；PF6原子荧光仪、TSA-986 原子吸收仪，北京普析有限公司；FDU-1200冷冻干燥机，日本东京Rikakikai公司；L-8900氨基酸分析仪，日本日立高科技有限公司；Mersham蛋白质纯化系统，美国曼德公司；Superdex peptide 10/300 GL分析柱，美国上海诺磁公司。

1.2 试验方法

1.2.1酶解提肽方法 前期阶段添加复合蛋白酶酶解[8]，将蛋白颗粒先被水解为肽片段，酶解条件：复合蛋白酶加酶量3.3%、温度57℃、酶解时间3.5h、pH7.1。结构松散后，离心得上清液，再加入风味复合酶实现第二阶段的酶解，去除苦味肽，离心后取上清液即为酶解成品。分段酶解技术不仅提高多肽得率，同时增加氨基酸含量，使鲜味更加浓郁。

1.2.2酶解工艺流程[9-10]原料→解冻→粉碎→虾鱼浆→混合液→复合蛋白酶水解→灭酶→离心→过滤→取上清液→风味蛋白酶水解→灭酶→离心→过滤→取上清液→成品

1.2.3基本指标测定 总氮量依据GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》方法测定[11]，氨基态氮含量根据ZBX 66038—1987《基态氮测定法》方法进行测定[12]。水解度的测定如式(1)所示，用以表征底物蛋白中被水解肽键数占肽键总数的百分含量[13]。

(1)

1.2.4响应面试验设计 针对采用风味酶对鲜味肽进行二次酶解试验中，以各酶解工艺参数酶解温度x1(℃)、酶解pH x2、酶解时间x3(h)、酶添加量x4(%)作自变量，鲜味肽水解率作响应值(表1)。

表1 因素水平编码

1.2.5酶解液多肽分子量分布 取离心后酶解液上清液，通过Amersham 蛋白纯化系统，Superdex peptide 10/300 GL分析柱，在洗脱液0.25 mol/L氯化钠、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液、pH 7.2、进样体积50 μL、检测波长214 nm、流速0.5 mL/min条件下[14]，进行酶解液多肽分子量分布测定。

1.2.6酶解液氨基酸分析[15]将定量样品移至水解管内，添加6 mol/L HCl，抽真空后并封管。于水解器中在110°C条件下水解24h。定容后进行过滤操作，对所得滤液加以干燥使其成固态，随后试样溶解于0.02 mol/L HCl并调整至适合的浓度，使用氨基酸分析仪进行氨基酸类型及组成成分测定[16-17]。

1.2.7酶解液美拉德反应 取分子量不同的酶解组分样品1.5 g，依次添加1.5 g葡萄糖、0.3 g食用姜粉、0.3 g NaCl、蒸馏水10 mL，加温至115°C后加热0.5h以开始美拉德反应，反应结束停止后即刻冷却样品至室温。随后用蒸馏水将反应溶液稀释到适宜浓度，留待感官评价[18]。

1.2.8调味料配方[19]以酶解浓缩液为基料，添加白砂糖、食盐、味精、淀粉(食品级)等辅料制备混合调味料。

1.2.9数据分析 每组试验重复3次，试验数据使用SigmaPlot 12.5软件绘制趋势曲线图。

2 结果与分析

2.1 风味蛋白酶酶解条件确定

通过单因素试验对风味蛋白酶的时间、酶添加量、pH及酶解温度等工艺条件进行优化，以确定风味蛋白酶酶解的最适工艺参数。

2.1.1风味蛋白酶酶解单因素试验

(1)加酶量对酶解效果的影响：由图1可知，pH调整至7、酶解时间1 h、酶解温度50°C时，水解度的变化趋势为先升高后降低。加酶量为1%时水解度最高。(2)酶解时间对酶解效果的影响：由图2可知，pH调整至7、酶添加量1%、酶解温度50℃时，水解度的变化趋势为先上升后下降。时间为2 h时水解度最高。(3)pH对酶解效果的影响：由图3可知，在酶解温度50℃、酶解时间1h、酶添加量1%，水解度的变化趋势为先上升后下降。pH为7时水解度最高。(4)温度对酶解效果影响：由图4可知，调整pH至7、酶解时间1 h、酶添加量1%，水解度的变化趋势呈先上升后下降。其中，酶解温度50°C时蛋白水解程度最大。

图1 加酶量对酶解效果的影响

图2 酶解时间对酶解效果的影响

图3 pH对酶解效果的影响

图4 温度对酶解效果影响

2.1.2风味蛋白酶酶解响应面试验结果

(1)风味蛋白酶酶解鲜味肽响应面试验：以单因素试验为基础，依照Box-Behnken响应面法的试验要求，开展多组试验(表2)。采用Design Expert软件分析，将温度、pH、酶解时间及酶添加量作响应变量，以水解率作响应值进行回归分析，得到预测模型如式(2)：

Y=63.51+1.85X1+2.46X2-2.76X3-3.68X4+4.98X1X2+0.50X1X3-0.22X1X4+1.92X2X3+2.81X2X4-3.08X3X4-5.39 X12-5.75X22-2.54X32-5.27X42

(2)

表2 响应方案及结果

表3 回归与方差分析结果

(2)因素间的交互作用：根据表3可得，交互项x1×x2对鲜味肽水解率影响极显著，重点分析交互项AB对水解度(Y)的影响，固定模型中的酶解时间x3=2h和加酶量x4=1%，x1×x2交互作用的三维曲面图与等高线图见图5。

图5 交互项x1×x2对水解度的影响

2.2 酶解液成分的测定

2.2.1酶解液中多肽分子量分布的测定结果 由图6～7可见，一次酶解液中多肽主要集中在3 000～5 000 Da以上，占到44.15%，大于10 000 Da肽段的比例最低，为4.67%。相比一次酶解液，二次酶解液中分子量大于5 000Da的肽段比例显著降低，1 000～3 000 Da肽段比例最大，可见，通过二次酶解能较好地降解大分子量的片断。酶解液通过二次酶解后，产物中分子量小于5 000 Da 的肽段比例显著提高，酶解产物中肽段分子量主要分布在1 000～3 000 Da及3 000～5 000 Da这两部分，占总肽段的比例为88.2%。

综上所述，通过复合酶水解能较好地降解海鲜中分子量大于10 000 Da的片断，酶解产物中分子量主要分布在3 000～5 000 Da，而经过风味蛋白酶进行二次酶解后，其中分子量大多分布于1 000～3 000 Da内。目前研究人员分离得到的鲜味肽也主要是分子量介于3 000Da以下的寡肽，可见，两次酶解液的肽分子量分布特点证明，二次酶解有助于酶解更加充分，使大分子量的肽分解成寡肽的转化率更高，更有助于鲜味的体现。

图6 一次酶解液的肽分子量分布

图7 二次酶解液的肽分子量分布

2.2.2最佳条件下酶水解液中氨基酸的含量测定

(1)复合蛋白酶水解液中氨基酸的含量：以复合蛋白酶酶解后样品中氨基酸量为参照，以其中氨基酸含量对后续试验中风味酶解对氨基酸的影响进行比对考察(表4)。(2)复合蛋白酶与风味蛋白酶分段酶解液中氨基酸含量：比对表4，参照表5可知，双酶水解后的水解液中，各种氨基酸的含量均有较显著提升。大量氨基酸是进行美拉德反应的先决条件，可见双酶解试验后不但能改善产品风味，还能大量提取初次水解液中的氨基酸，试验效果十分显著。

表4 复合蛋白酶解液中各种氨基酸的含量

表5 分段酶解液中各种氨基酸的含量

2.2.3美拉德验证风味试验 通过初次水解液及风味酶二次水解液的美拉德反应，判断对比其最终风味。从表7可以看出，单一酶水解得到的水解液经美拉德反应后烤鱼味一般，呈现苦腥味；而经复合及风味蛋白酶二次水解后的水解液感官上均好过仅经单一酶水解的样品，故经复合蛋白酶及风味蛋白酶二次水解是必要的。

表6 美拉德反应感官评定

2.2.4调味料的制备 以酶解液为基料，按照以下配方进行调配：酶解液100 mL、白糖8 g、食盐4 g、酱油14 mL、淀粉7.5 g、海藻酸钠0.05 g、姜汁3 mL、香油2 mL，加热浓缩至一定稠度后即可制备出具有海鲜风味的复合调味料。该产品呈半流体状、味道鲜美、口感天然，具有海产品特有香气，其产品质量指标见表7。

表7 复合调味料质量指标

3 结论

试验选择对虾及沙丁鱼作原材料，利用复合蛋白酶及风味蛋白酶双酶定向分段酶解手段生产高附加值鲜味提升肽，充分实现了对水产资源的高效利用。在采用复合蛋白酶初步水解基础上，确定风味蛋白酶二次酶解生产鲜味肽的最佳工艺参数：温度51℃、pH 7.1、酶解时间1.9h、酶添加量1.0%，该条件下实现的双酶解工艺使得水解率高达64.24%。相较于初次酶解，风味酶的二次水解能够显著提升酶解液内氨基酸含量，且二次水解液经美拉德反应后质量也明显优于初次水解液。以二次水解液为基料开发海鲜调味料，产品风味宜人，工艺简便且不需添加味精或其他鲜味剂，口味自然，具有较乐观的开发前景及市场预期。◇