生物酶法提取葡萄皮渣多酚工艺研究

海 玲，张爱栋，张尔珂，豆彤彤，杨学山

（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

甘肃省河西走廊气侯较为干燥，昼夜温差较大，日照强，土壤呈沙性，富含钙质，非常适合酿酒葡萄的种植与生产[1]。随着葡萄产量的增长和葡萄加工业的迅猛发展，葡萄酒酿造的副产物（葡萄皮、籽和果梗）迅速增长[2]。目前，除部分酿酒葡萄皮渣被用作肥料、饲料，大部分被闲置废弃，资源化利用率较低，且造成了环境污染，严重制约了甘肃葡萄酒产业的可持续发展。

葡萄皮渣中含量丰富的多酚类化合物具有较强的抗氧化活性，能够降低炎症，抑制肿瘤发展，具有促凋亡和抗血管生成作用。此外，多酚类物质还能够增加毛细血管阻力，保护心血管系统以及视网膜[3-5]。近年来，虽然有机溶剂提取法已大量应用于多酚物质的分离纯化，但易造成二次污染，从而制约了葡萄皮渣提取物在医药、食品、化妆品等行业的应用[6-7]。与传统提取法相比，酶法提取反应条件温和，绿色无污染且选择性强，纤维素酶可破坏植物的细胞壁，有利于植物生物活性物质的提取[6]。据文献报道，酶法已成功应用于黑加仑茶多酚[5]、石榴籽[7]、葡萄籽[8]和山楂叶[9]等不同植物基质中多酚物质的提取，而关于纤维素酶解提取葡萄皮中多酚物质的研究则少见报道。

本研究以甘肃河西走廊产区酿酒葡萄主栽品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）酿酒后的皮渣为原料，采用纤维素酶法提取其中的多酚物质，通过单因素结合正交实验，优化提取工艺参数，以期为葡萄皮渣多酚化合物的开发利用提供可行依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

原料：赤霞珠葡萄皮渣，采自甘肃农业大学食品学院葡萄酒生产车间。

试剂：纤维素酶（上海源叶生物科技有限公司，酶活力400 U/mg）、Folin-Ciocalteus。

显色剂、氢氧化钠、无水碳酸钠、没食子酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；TU-1810紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；TD5A-WS台式低速离心机（东莞康润实验科技有限公司）；CPJ214电子天平；恒温水浴箱等。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄皮渣多酚的提取

将酒精发酵结束后的赤霞珠葡萄皮渣去籽，置于鼓风干燥箱中60℃干燥24 h，经超碎粉碎机得到葡萄皮粉末作为实验原料，于4℃冰箱中储存备用。采用纤维素酶酶解、水浴浸提多酚类物质。

1.3.2 葡萄皮渣多酚的测定

采用福林-肖卡法[10]测定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL样品溶液，加入5 mL蒸馏水、1 mL Folin-Ciocalteus显色剂和3 mL 7.5%Na2CO3溶液。避光室温下放置2 h显色后，在765 nm波长下测定吸光度，再根据标准曲线方程（y=0.116x-0.02，R2=0.9995）计算样品中多酚的质量浓度。葡萄皮渣多酚得率按以下公式计算：

式中：ω为多酚得率，%；C为根据标准曲线计算得到的多酚质量浓度，μg/mL；V为提取液的体积，mL；m为葡萄皮渣的质量，g。

1.3.3 单因素实验设计

1.3.3.1 纤维素酶添加量对多酚得率的影响

准确称量葡萄皮粉末0.500 g，分别加入质量为10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg的纤维素酶，在酶解温度50℃，pH 5.0的条件下酶解2 h，离心10 min后取上清液，测定不同纤维素酶添加量下得到的葡萄皮渣多酚的得率。

1.3.3.2 酶解液pH值对多酚得率的影响

固定纤维素酶添加量，调节酶解液pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其他操作同上。测定多酚得率，选出较佳酶解pH值。

1.3.3.3 酶解时间对多酚得率的影响

固定纤维素酶添加量和酶解pH值，设置酶解时间分别为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，其他操作同上。测定多酚得率，选择较佳酶解时间。

1.3.3.4 酶解温度对多酚得率的影响

固定纤维素酶添加量、酶解pH值和酶解时间，设置酶解温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，其他操作同上。测定多酚得率，选出较佳酶解温度。

1.3.4 正交实验

根据单因素实验结果，选取酶添加量、酶解pH值、酶解时间和酶解温度作为实验因素，采用L9（34）正交表，做4因素3水平实验。通过对各组样品多酚得率的测定，选出最佳工艺条件。实验因素和水平设计见表1。

表1 正交实验因素和水平

1.3.5 最佳工艺条件的验证

按照正交实验优选的各参数，进行葡萄皮渣多酚最佳提取条件的验证。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 纤维素酶添加量对多酚得率的影响（图1）

图1 不同酶添加量对多酚得率的影响

由图1可知，随着纤维素酶添加量的不断增加，葡萄皮中多酚得率呈现先上升后下降的趋向，其中酶得率为20 mg时，多酚得率达到最大值。结果表明，随着纤维素酶添加量的增加，葡萄皮细胞壁的破碎程度进一步加大，从而更有利于细胞内多酚物质的溶出；当酶得率继续增加时，由于其底物浓度不足，使过多的酶聚集于皮渣表面，从而阻碍了细胞内多酚物质的扩散和溶出，使多酚得率下降[10]。因此，纤维素酶的较佳添加量为20 mg。

2.1.2 酶解液pH值对多酚得率的影响（图2）

图2 不同酶解pH值对多酚得率的影响

由图2可知，当pH值增加至5时，多酚得率达到最大值，之后随着pH值的继续增大，多酚得率迅速降低。这是由于pH值会影响纤维素酶的活性中心，在pH5时，酶催化的活性中心最易与底物相结合，促进了细胞破碎，从而提高了胞内物质的溶出比例。而当pH值发生变化时，酶虽不会变性失活，但酶活性中心部位发生改变，从而降低酶活力，影响多酚物质的充分扩散，使得率下降[11]。

2.1.3 酶解时间对多酚得率的影响（图3）

图3 不同酶解时间对多酚得率的影响

如图3所示，随着酶解时间的逐渐延长，葡萄皮中多酚得率不断增加，当酶解时间达2 h后，随时间的延长多酚得率逐渐降低。在1.5～2.5 h时，随着时间的延长，葡萄皮细胞壁及细胞间的阻挡层已被有效水解，使多酚物质充分溶出[12]。而过长的处理时间易引起多酚物质的氧化分解，使提取量降低，因此选择酶解时间为2 h，此时效果较好。

2.1.4 酶解温度对多酚得率的影响（图4）

图4 不同酶解温度对多酚得率的影响

由图4可知，纤维素酶提取葡萄皮中多酚的较适作用温度是55℃。在55℃之前，随着温度的不断升高，细胞内活性物质分子运动速率和酶促反应随之加快，破壁作用加强，使多酚物质充分释放于提取液中[13-14]；随后，温度的继续升高易使多酚物质分解，还会破坏酶的结构，使酶活性下降，从而影响多酚得率。由此选择55℃为较好的提取温度。

表2 正交实验结果

2.2 正交实验结果

为确立酶法提取葡萄皮渣多酚的最优工艺，根据单因素实验结果，进行L9（34）正交实验，正交实验结果见表2。为判断上述4种因素对实验结果的影响程度，应用SPSS20.0对正交实验结果进行方差分析，利用F检验判断各因素对实验指标的影响程度，结果见表3。

表3 方差分析表

由表2可知，影响赤霞珠葡萄皮中多酚提取量的主次因素依次为C＞B＞D＞A，即时间＞酶解pH＞酶解温度＞酶添加量。由表3方差分析可知，因素B和因素D显著，因素C极显著，即pH值、温度和时间对葡萄皮渣多酚的得率均具有显著性影响，而酶添加量对其无显著性影响。纤维素酶提取葡萄皮渣多酚的最佳组合为A3B2C2D1，即酶添加量25 mg，酶解pH5，酶解时间2 h，酶解温度50℃。

根据正交实验所得的最优组合（A3B2C2D1）进行验证实验，实验结果表明，在此工艺条件下提取得到的葡萄皮中多酚得率达到11.238 mg/g，均高于正交实验结果，表明本试验优化的工艺条件有较好的可行性。

3 结论

通过单因素结合正交实验优选赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取工艺参数为酶添加量25 mg，酶解液pH5，酶解时间2 h，酶解温度50℃。该法有效缩短了提取时间，节约了成本，而且多酚结构不易被破坏，与传统提取方法相比，提取溶剂绿色、安全、无污染，具有一定的推广和应用价值。