润光养生美容酒皮肤急性毒性、皮肤刺激性及黏膜刺激性实验研究

苏 乔，李武国，李雯雯，赵广银，周永标，李润光，潘卫松

（1.中山大学附属第一医院动物实验中心，广东广州510080； 2.广州市药品检验所，广东广州510610；3.广东省鹤山市昆仑养生美容酒厂有限公司，广东江门529700）

润光养生美容酒是中医养生美容专家李润光教授在祖传养生美容宝典《回春部》的基础上，结合现代中医养生美容理论研制出来的一种可供内服、外用的酒剂。它主要由乌梅、桂圆肉、枸杞、陈皮、黑枣、茯苓、佛手、罗汉果、山楂、花椒等中药经露酒浸泡制得。该酒在临床上被用于外敷，灌注直肠、阴道等。本研究对其皮肤急性毒性、皮肤刺激性以及黏膜刺激性进行研究，为其在临床上的安全应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

普通级新西兰兔88只，雌雄兼有，体重1.8～3.3 kg，广州市花都区花东信华实验动物养殖场（实验动物生产许可证编号为SCXK（粤）2014—0023）；SPF级雌性SD大鼠30只，180～200 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司（实验动物生产许可证编号为SCXK（湘）2011—0003）；润光养生美容酒（酒精度为45%vol）、润光养生美容酒酒基（酒精度为60%vol）（以下简称酒基），广东省鹤山市昆仑美容酒厂有限公司；注射用水（批号：1501033205）石家庄四药有限公司；0.9%氯化钠注射液（批号：N15040203-1），四川科伦药业股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 完整皮肤急性毒性试验[1]

普通级新西兰兔12只，雌雄兼有，体重2.7～3.3 kg。于给药前24 h，电动剃毛刀将背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为体表面积的10%。去毛后24 h检查去毛皮肤是否因去毛而受伤，受伤的皮肤不宜作完好皮肤的毒性试验。按体重分笼，随机分为3组，每组4只，雌雄兼有，以受试物4 mL/只的剂量作为高剂量组，以受试物1 mL/只的剂量作为低剂量组，溶剂对照组给予酒基应用液（酒精度为45%vol），每只兔涂抹1 mL。受试物均匀涂于脱毛区，并用无刺激性纱布胶布加以固定。每只动物分笼饲养。给受试物24 h后，以温水除去残留的受试物，去除受试物后1 h、24 h、48 h、72 h至第7天，每日观察并记录动物的体重、皮肤毛发、眼和黏膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现，若遇有死亡动物，应及时进行尸检和肉眼观察，当肉眼可见病变时，应进行病理组织学检查。

1.2.2 破损皮肤急性毒性试验[1]

普通级新西兰兔12只，雌雄兼有，体重2.7～3.3 kg。于给药前24 h，电动剃毛刀将背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为体表面积的10%。用8号针头划破皮肤至微微渗血。按体重分笼，随机分为3组，每组4只，雌雄兼有，以受试物4 mL/只的剂量作为高剂量组，以受试物1 mL/只的剂量作为低剂量组，溶剂对照组给予酒基应用液（酒精度45%vol），每只兔涂抹1 mL。受试物均匀涂于脱毛区，并用无刺激性纱布胶布加以固定。每只动物分笼饲养。给受试物24 h后，以温水除去残留的受试物，去除受试物后1 h、24 h、48 h、72 h至第7天，每日观察并记录动物的体重、皮肤毛发、眼和黏膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现，若遇有死亡动物，应及时进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，应进行病理组织学检查。

1.2.3 完整皮肤刺激性试验[2]

普通级新西兰兔4只，雌雄兼有，体重2.7～3.1 kg。于给药前24 h，电动剃毛刀将背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为体表面积的10%。去毛后24 h检查去毛皮肤是否因去毛而受伤，受伤的皮肤不宜作完好皮肤的刺激性试验。试验采用同体左右侧自身对比，左侧去毛区涂受试物1 mL，右侧涂1 mL酒基应用液（酒精度为45%vol）作为对照，用无刺激性纱布、胶布加以固定。每只动物分笼饲养。给受试物24 h后，以温水除去残留的受试物，去除受试物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼观察和病理组织学检查并记录涂抹部位有无红斑和水肿等情况，按《中药新药研究指南》皮肤刺激性反应评分标准进行评分，记录各时日的评分值及恢复情况和时间。

1.2.4 破损皮肤刺激性试验[2]

普通级新西兰兔4只，雌性雄性兼有，体重2.7～3.1 kg。于给药前24 h，电动剃毛刀将背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为体表面积的10%。用8号针头划破皮肤至微微渗血。试验采用同体左右侧自身对比，左侧去毛区涂受试物1 mL，右侧涂1 mL酒基应用液（酒精度为45%vol）作为对照，用无刺激性纱布、胶布加以固定。每只动物分笼饲养。给受试物24 h后，以温水除去残留的受试物，去除受试物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼观察和病理组织学检查并记录涂抹部位有无红斑和水肿等情况，按《中药新药研究指南》皮肤刺激性反应评分标准进行评分，记录各时日的评分值及恢复情况和时间。

1.2.5 兔直肠刺激性试验[3]

预试验：普通级雌性新西兰兔10只，体重1.8～2.2 kg。经由直肠用F10导尿管插入深度为8 cm，灌注给入润光养生美容酒原液（酒精度45%vol），灌注剂量为10 mL/kg·BW，共灌注3次，每次间隔10 min，灌注前禁食16 h，不禁水，灌注后30 min内全部死亡。

正式试验：普通级雌性新西兰兔46只，体重1.8～2.8 kg。按体重分笼，随机分为6组，润光养生美容酒高剂量（酒精度为3.6%vol）组、低剂量（酒精度为1.8%vol）组，每组10只；酒基（酒精度为3.6%vol）组，9只；生理盐水组，8只；器械对照组，6只；正常对照组，3只。取润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol），经注射用水稀释配制成酒精度为3.6%vol和1.8%vol的受试液，另外酒基同法配制成酒精度为3.6%vol的受试液。动物用F10导尿管插入直肠深度为8 cm，灌注给入上述浓度的溶液，每次灌注剂量为10 mL/kg·BW（灌注前禁食16 h，不禁水），共灌注3次。每次间隔10 min，受试液自然流出。正常对照组不作任何处理，常规饲养。器械对照组按上述流程进行，但不灌注任何溶液。观察给受试液后24 h、48 h时，受试物全身及局部刺激反应情况。24 h、48 h后处死部分动物，取直肠，观察肠黏膜有无充血、水肿等变化，并作病理组织学检查，与对照组比较。部分留存动物逐日观察并记录其体重、呼吸、循环、中枢神经系统及四肢活动等变化情况。第7天处死动物检查直肠黏膜组织的变化。

1.2.6 大鼠阴道刺激性试验[3]

SPF级雌性SD大鼠30只，体重为180～200 g，按体重分笼，随机分为3组，润光养生美容酒（酒精度为45%vol）组、酒基（酒精度为45%vol）组和生理盐水组，每组10只。各组采用F8导尿管阴道灌注给予相应受试物，导尿管插入深度为2 cm，灌注后用火棉胶封住阴道口4 h。观测给受试物后24 h时全身情况及局部刺激反应。24 h后处死部分动物，取阴道，观察黏膜有无充血、水肿等变化，并作病理组织学检查，与对照组比较。部分留存动物逐日观察并记录其全身状况。体重、呼吸、循环、中枢神经系统及四肢活动等变化。第7天处死动物检查阴道的变化。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 完整皮肤急性毒性试验

在完整皮肤急性毒性试验中，试验动物完整皮肤1 d内分别涂抹润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）1 mL和4 mL，动物进食、活动正常，体重增加，未见经皮肤吸收引起的毒性反应。

2.2 破损皮肤急性毒性试验

在破损皮肤急性毒性试验中，试验动物破损皮肤1 d内分别涂抹润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）1 mL和4 mL，动物进食、活动正常，体重增加，未见经皮肤吸收引起的毒性反应。

2.3 完整皮肤刺激性试验

在完整皮肤刺激性试验中，试验动物完整皮肤涂抹润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）1 mL，未见经接触皮肤后产生的刺激性反应。

2.4 破损皮肤刺激性试验

在破损皮肤刺激性试验中，试验动物破损皮肤涂抹润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）1 mL，未见经接触皮肤后产生的刺激性反应。

2.5 兔直肠刺激性试验

2.5.1 预试验

在兔直肠刺激性试验预试验中，润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）灌注剂量为10 mL/kg·BW（共灌注3次，每次间隔10 min），经兔直肠黏膜给入可引起动物死亡，产生急性毒性反应。

2.5.2 正式试验

图1 润光养生美容酒对兔直肠黏膜的刺激性试验病理学检测结果（HE，×100）

各组动物经解剖肉眼检查直肠黏膜组织外观、色泽、大小正常。显微镜下黏膜表层完整，黏膜面未见异常渗出、出血、糜烂等；腺体未见萎缩或增生等；黏膜下层未见水肿（见图1）。与正常对照组比较，生理盐水组、器械对照组在灌注后24 h、7 d均没有显著的变化。与生理盐水组比较，润光养生美容酒酒精度为3.6%vol组在灌注后24 h并没有显著的变化，48 h后出现了严重的炎症反应，7 d后炎症反应恢复到了生理盐水组的水平；酒精度为1.8%vol组在灌注后24 h、48 h与7 d均出现了比生理盐水组稍严重的炎症反应；而酒基（酒精度为45%vol）组在灌注后24 h、48 h出现了严重的炎症反应，7 d后炎症反应减轻，但并未能恢复到生理盐水组的水平。结果显示，润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol），经稀释后酒精度为3.6%vol和1.8%vol的稀释液以及3.6%vol的酒基稀释液均能对兔直肠黏膜产生刺激性作用。

图2 润光养生美容酒对大鼠阴道黏膜刺激性试验病理学检测结果（HE，×400）

2.6 大鼠阴道刺激性试验

在大鼠阴道灌注剂量为10 mL/kg·BW的刺激性试验中，生理盐水组、酒基（酒精度为45%vol）组和润光养生美容酒原液（酒精度为45%vol）组经肉眼检查大鼠阴道组织外观、色泽、大小正常。显微镜下检查阴道组织内膜呈相应生理周期正常改变；未见腺体异常增生或萎缩（见图2）。样品原液与生理盐水组比较对大鼠阴道刺激性无显著性差异。

3 结论

润光养生美容酒原液未见经皮肤吸收引起的急性毒性反应和经接触皮肤后产生的刺激性反应。润光养生美容酒原液以及经稀释至酒精度为3.6%vol、酒精度为1.8%vol的稀释液均能对兔直肠产生刺激性作用。润光养生美容酒原液对大鼠阴道未见刺激性作用。