湖北麦冬叶片碳代谢对土壤干旱的响应

孙永林， 汤尚文， 徐 馨， 柯亚婕， 王启会

(湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北襄阳 441053)

在全球气候变暖的背景下，干旱已成为限制作物生长和产量最重要的生态因子。据全球气候评估权威组织-机构——政府间气候变化委员会(IPCC)报道，到21世纪末，地球表面温度将会升高1.1～6.4 ℃[1]。随着气候变暖的发展，水分蒸发量将会进一步加大，水分亏缺将会加剧，干旱发生的频率和强度也会增加，持续的时间也会更长[2]。干旱主要通过降低植物的吸水能力从而影响植物的生长，而低水分供应下植物生长受限主要是因为碳代谢受阻。碳代谢是植物生命活动的中心，植物要想长期存活需要同化足够多的碳来构建生物量。植物体内的碳可分为两大类，一类是以纤维素、木质素等为代表的用来进行形态建成的结构性碳，另一类是以可溶性糖和淀粉为代表的非结构性碳，非结构性碳可在植物遭受环境胁迫时起阶段性缓冲作用[3]。以往研究表明，在轻度和中度水分亏缺下，碳代谢主要受气孔关闭的限制，气孔关闭降低了胞间二氧化碳的浓度，导致二氧化碳扩散到羧化位点的速率降低。随着干旱程度的进一步加剧或干旱持续时间的延长，光合酶活力降低、细胞结构破坏等代谢损伤就会发生，在这种情况下，非结构性碳将会更多地分配给可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等富含碳元素的渗透调节物质，从而调节细胞的渗透压[4-8]。

湖北麦冬[LiriopeSpicata(Thunb.) Lour. var.proliferaY. T. Ma]是百合科山麦冬属药食两用植物，块根质地柔韧，味甘，含有多糖、皂苷、黄酮等人体所需的营养成分，具有滋阴生津、润肺止咳等功效，是襄阳大宗道地药材，产量高于川、杭麦冬[9]。襄阳地处鄂西北，是湖北季节性干旱易发地区，从2010—2016年，旱情逐渐加重，重旱、特重旱频发，且大旱年出现的频率呈增加趋势，农作物欠收甚至绝收，对农业生产造成严重的影响。对湖北麦冬这种中药材而言，前人对其生药学特性进行了大量研究[10-13]，但对在持续干旱条件下碳代谢的研究尚未涉及。本试验采用生物化学的方法，对生长在持续干旱条件下的盆栽湖北麦冬叶片中与碳代谢相关的光合色素及关键酶活力进行了分析，同时测定了非结构性碳(可溶性糖、淀粉和脯氨酸)的含量，从而揭示持续干旱条件下湖北麦冬的抗旱机制，为其规模化种植提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

盆栽试验在湖北文理学院鄂西北植物研究所内进行。2015年3月初，从襄阳市欧庙镇麦冬种植基地选取长势基本一致、生长状况良好的一年生麦冬苗，单株移栽于规格相同的塑料桶(口径27.5 cm、底径22 cm、高31 cm，容积约为19 L)内，桶内装当地黄棕壤土8 kg，土壤田间持水量为36.60%。先正常供水4周以保证移栽后的麦冬苗正常生长，4月1日停止浇水，对照组正常供水，每隔10 d收样1次，共收样3次(0、10、20 d)。每次收样各处理各收5个重复，样品置于 -80 ℃ 超低温冰箱用于生理指标的测定。试验期间，晴天露天培养，阴雨天则置于遮雨棚内。

1.2 测定指标

1.2.1 叶相对含水量 参照Galle等的方法[14]测定麦冬叶相对水分含量(relative water content，RWC)。选择长势良好、大小基本一致的5株麦冬，取发育完全的叶片5片，分别称其鲜质量(FW)，然后将叶浸没于蒸馏水中，置于4 ℃下至饱和状态后取出，擦干表面水分测其饱和鲜质量(TW)，再将叶片在鼓风干燥箱内80 ℃下烘干至恒质量(DW)。按照下列公式计算出RWC：

RW=(FW-DW)/(TW-DW)×100%。

1.2.2 光合色素的含量 光合色素的提取采用高俊凤的方法[15]。准确称取30 mg叶片，研磨成匀浆后，加入80%的丙酮1.9 mL，暗中提取24 h，室温条件下离心10 min(15 000 r/min)。取上清液0.5 mL，加入80%丙酮2 mL，在波长为663、645、470 nm处测吸光度，测得叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量，叶绿素a与叶绿素b之和即为叶绿素总量，同时测得叶绿素a和叶绿素b的比值。空白对照为80%的丙酮。

1.2.3 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活力测定 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力测定参照Dewir等的方法[16]略有改动。称取鲜叶300 mg在液氮中研磨成粉末状，加入1 mL预冷的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH值 7.5，内含16 mg PVP、1 mmol/L二硫苏糖醇、0.2 mmol/L EDTA·Na2、5 mmol/L巯基乙醇、10 μL Triton、2 mmol/L MgCl·6H2O和5 mmol/L NaHCO3)，4 ℃下离心20 min(15 000 r/min)，上清液即为粗酶液。反应体系包括 100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L MgCl·6H2O、3.5 mmol/L ATP、3.5 mmol/L 磷酸肌酸、0.4 mmol/L NADH、0.24 U/μL磷酸肌酸激酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油醛脱氢酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油酸激酶、0.5 mmol/L RUBP，用100 μL粗酶液启动反应，28 ℃下测定在340 nm波长下吸光度的变化，共测3 min，以1 min酶活力变化0.01为1个酶活单位(U)。

1.2.4 可溶性糖含量 可溶性糖含量的测定采用蒽酮-H2SO4比色法[17]。

1.2.5 淀粉含量 淀粉含量的测定采用高俊凤的方法[15]。准确称取叶片30 mg，用80%乙醇溶液1.5 mL在80 ℃水浴条件下提取30 min，冷却至室温后，4 ℃下离心20 min(15 000 r/min)，弃去上清液，往沉淀中再加入80%乙醇溶液1.5 mL，按照同样的方法再提取2次，留沉淀。往沉淀中加入蒸馏水0.4 mL，沸水浴1 h，冷却至室温后，往其中加入9.2 mol/L HClO4，搅拌15 min，再加蒸馏水0.8 mL，混匀后，15 000 r/min离心10 min，取上清液500 μL，加蒽酮-H2SO4溶液2 mL，沸水浴10 min，冷却至室温后，在620 nm处测定吸光度。

1.2.6 脯氨酸含量 脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法[15]。

1.3 数据处理

所得数据采用Excel软件计算平均值和标准差，用SPSS 17.0分析不同水分处理之间的差异显著性(P<0.05)，并用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 干旱对湖北麦冬叶片相对水分含量的影响

RWC是表征植物组织水分状况的重要指标。由图1可知，在正常水分条件下，随着时间的延长，叶片RWC无显著性变化。但在干旱条件下，随干旱持续时间的延长，叶片RWC显著降低(P<0.05)，与对照相比，当干旱持续10 d时，RWC含量降低了6.4%，而当干旱持续20 d时，RWC含量降低了14%，表明土壤中的水分状况直接影响植物叶肉组织内的水分分布，可能因为土壤干旱发生后，植物根系的吸水能力减弱，通过质外体和共质体途径运输到叶片中的水分也会相应减少，干旱持续时间越长，这种影响越显著。

2.2 干旱对湖北麦冬叶片光合色素的影响

光合色素是植物吸收光能进行光合作用的重要物质，主要包括叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素，主要参与光能的吸收、传递并引起原初光化学反应。由表1可知，在正常水分条件下，3类色素的含量均有增加，但并不显著。在干旱10 d时，与对照相比，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著降低(P<0.05)，在持续干旱20 d时，降幅更大。但持续干旱10 d和20 d时，叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量无显著差异。另外，叶绿素a含量与叶绿素b含量比值(叶绿素a/b)为3左右。表明持续干旱对光合色素的含量有显著影响，但相比之下对叶绿素a的影响较为显著。

表1 干旱对湖北麦冬光合色素的影响

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.3 干旱对湖北麦冬叶片核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力的影响

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是光合碳同化过程中卡尔文循环里催化羧化反应的关键酶，进入叶绿体的CO2与其受体核酮糖-1，5-二磷酸在Rubisco的催化下生成3-磷酸甘油酸，CO2得以固定，从而实现了无机物向有机物的转化[18]。由图2可知，在正常水分供应的条件下，随发育时间的延长，Rubisco活力显著增强并趋于稳定。当土壤干旱持续10 d时，受旱植株的Rubisco活力与对照相比无显著性变化，但随着干旱时间的进一步延长，当持续干旱20 d时，受旱植株的Rubisco活力显著降低(P<0.05)。表明一定程度的土壤干旱对植物的羧化反应并无显著性影响，而持续干旱则严重降低Rubisco催化能力，从而影响着植物的光合碳固定。

2.4 干旱对湖北麦冬叶片可溶性糖含量的影响

土壤干旱可导致植物遭受渗透胁迫，在一定的胁迫范围内，植物可通过在细胞内累积无机离子或有机溶质进行渗透调节以维持细胞的膨压。可溶性糖是重要的有机渗透调节物质，对细胞压力势的维持起重要调节作用[19]。由图3可知，在正常水分条件下，湖北麦冬叶片内可溶性糖含量无显著性变化。当遭受10 d的干旱胁迫时，与对照相比，受旱植株叶片内可溶性糖含量显著升高(P<0.05)，而当干旱持续到 20 d 时，可溶性糖含量则显著降低(P<0.05)。表明在干旱条件下，湖北麦冬可通过在叶肉细胞内累积可溶性糖以调节渗透势，从而抵抗干旱胁迫。而当持续干旱进行到一定程度后，植物的渗透调节能力受限，从而表现为参与渗透调节的物质含量显著降低。

2.5 干旱对湖北麦冬叶片淀粉含量的影响

可溶性糖和淀粉是植物在叶绿体中经光合碳同化合成的2种重要的非结构性碳水化合物，在一定条件下，植物体可发生同化物的再分配和再利用。在逆境条件下，淀粉可通过水解作用转化为蔗糖、葡萄糖等可溶性糖进行渗透调节[3]。由图 4可知，在正常供水条件下，淀粉含量无显著性变化，随着发育时间的延长，则呈显著增加趋势。持续干旱对淀粉含量的影响较为明显，当干旱持续10 d时，与对照相比，淀粉含量显著降低(P<0.05)，当干旱持续20 d时，淀粉含量则进一步降低。表明干旱可引起非结构性碳水化合物的再分配，干旱条件下分配给用于淀粉合成的碳减少，而分配给可溶性糖的碳增多，从而缓冲了干旱胁迫对湖北麦冬叶片造成的伤害。

2.6 干旱对湖北麦冬叶片脯氨酸含量的影响

脯氨酸是植物蛋白质的重要组分，在正常状态下，脯氨酸的含量很低，但在逆境条件下游离脯氨酸会大量累积[18]。由图 5可知，在正常水分条件下，叶片内脯氨酸含量随发育进程的延续无显著性波动。但当干旱进行10 d时，与对照相比，脯氨酸含量显著增加(P<0.05)，而当干旱持续20 d时，脯氨酸含量显著增加(P<0.05)，但增幅减小。表明在干旱条件下，植物在细胞内累积较多的脯氨酸以增强渗透调节能力，但干旱持续到一定程度时植物体内脯氨酸的累积量减少，渗透调节能力减弱。脯氨酸累积还可能降低干旱期间蛋白质大量水解产生的游离氨对植物的毒害，贮存氮源和碳源，为逆境解除后恢复生长提供能源。

3 讨论与结论

代谢是植物最基本的生命活动过程，碳代谢在植株体内的动态变化直接影响着光合产物的形成、转化以及产量的形成[20]。光合作用是植物最基本的生理过程之一，也是碳代谢的一个重要组成部分[21]。叶片中叶绿素含量和Rubisco 活性直接影响植物的光合固碳能力。植物通过根系从土壤中吸收水分，利用光能将水和二氧化碳同化形成碳水化合物，而水分不仅是碳代谢的原料，而且也是酶发挥催化效能的媒介物质，因此，土壤水分的供应状态直接影响植物的光合碳代谢能力。在本研究中，随着干旱持续时间的延长，叶片中RWC含量显著降低，叶绿素的合成速度减慢，从而导致光合色素含量的降低，再加上Rubisco活力显著降低，因此严重影响湖北麦冬的光合碳固定能力。以往研究表明，轻度干旱对水稻Rubisco活力无显著性影响，重度干旱则抑制Rubisco活力从而导致光合速率下降[22]。Majumdar 等以大豆为试验材料研究干旱胁迫对Rubisco活力的影响，发现Rubisco活力在短期干旱胁迫的早期急剧下降，暗示Rubisco活力对水分胁迫比较敏感[23]。本研究也得出类似的结果，表明土壤干旱通过影响碳代谢过程中的光合色素及光合酶活力等因素，进而影响着植物对二氧化碳的羧化和固定能力，而且干旱程度越深，影响越显著。

非结构性碳水化合物(主要包括可溶性糖和淀粉)是植物碳代谢的重要产物，其含量变化不仅能反映植物体内的生理状况，而且还能在植物遭受环境胁迫时起一定的缓冲作用[3]。当植物处在逆境条件下通过光合碳固定制造的有机碳水化合物的量不能满足代谢的需求时，只能对有限的碳水化合物进行重新分配和利用以提高其利用效率，从而保证在逆境条件下的生长发育[19]。而重新分配和利用的途径之一便是合成较多的如可溶性糖、脯氨酸等富碳化合物，从而增加细胞内溶质的浓度以调节渗透压[18]。在本研究中，在干旱胁迫下，湖北麦冬叶片内非结构性碳之间相互转化，在干旱持续10 d时，淀粉含量显著降低，而可溶性糖含量显著升高，暗示湖北麦冬在光合酶活力降低的情况下对叶片内的碳水化合物进行了重新分配。而可溶性糖含量的升高可增强细胞的渗透调节能力，除此以外，富碳分子脯氨酸的含量也显著升高，渗透调节能力进一步增强。但干旱持续到一定时间后，湖北麦冬叶片内非结构性碳及脯氨酸含量均显著降低，表明渗透调节能力具有一定的局限性，与干旱胁迫持续的时间及胁迫强度密切相关。

因此，干旱对湖北麦冬叶片内的碳代谢有着显著的影响，在干旱持续10 d时，光合色素含量、Rubisco活力降低，暗示光合碳固定能力降低。在此情况下，湖北麦冬对叶片内有限的碳水化合物进行了重新分配和利用，将有限的碳更多地分配给可溶性糖和脯氨酸等富碳分子，以提高细胞的渗透调节能力，从而抵御干旱胁迫。但随着干旱时间的进一步延长，碳代谢及渗透调节能力均降低。