雷公藤内酯对睾丸切除雄性大鼠骨丢失的保护作用实验研究

江亚 詹俊锋 王林 刘群 刘锴 陈燕 卞育俊 吴刚 杨祖华*

1. 合肥市第三人民医院骨2科，安徽 合肥 230022 2. 安徽医科大学第二附属医院骨2科，安徽 合肥 230000 3. 皖南医学院弋矶山医院创伤骨科，安徽 芜湖 241000

流行病学研究表明，随着年龄的增加，男性股骨颈、髋部和前臂远端的骨密度降低，尤其是50岁以后[1]。骨质疏松症被定义为退行性骨骼疾病，其特征在于骨量减少和微结构退化，导致骨折风险增加[2]。虽然男性脆性骨折不太常见，但与女性相比，其发病率和死亡率更高[3]。雷公藤多甙已被广泛用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮和强直性脊柱炎等各种疾病[4-6]。雷公藤内酯醇是雷公藤多甙的主要成分，以其抗炎和免疫抑制活性而闻名[7]。最近，雷公藤内酯的心血管保护和抗肿瘤特性引起了研究人员的注意，此外，雷公藤也因其对其他病理状况的潜在有益作用而引起研究人员的注意[8]。最近的研究表明，雷公藤内酯醇能够通过抑制破骨细胞发育所需的RANKL诱导的NF-κB活化来抑制破骨细胞形成，进一步研究表明雷公藤内酯醇可以预防大鼠模型中钛颗粒引起的局部骨质疏松症的作用[8]。

基于上述所述，雷公藤内酯显示出对骨丢失疾病的潜在影响。然而，雷公藤内酯对治疗男性骨质疏松症的潜在治疗作用尚未被研究。因此，笔者进行了这项体内研究观察雷公藤内酯对睾丸切除雄性大鼠骨丢失的保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物和治疗

3月龄体重230～260 g雄性Sprague-Dawley大鼠，购自上海动物史莱克公司。大鼠适应饲养1周后，将30只大鼠随机分为3组即对照组(Sham组)、睾丸切除组(CON组)和雷公藤内酯治疗组(LGT组)，每组 10大鼠。睾丸切除组和雷公藤内酯治疗组双侧睾丸均被切除，而对照组阴囊被打开但睾丸被保留。雷公藤内酯治疗组术后大鼠腹腔注射上海纯优生物提供的雷公藤内酯醇15μg/(kg·d)，对照组和睾丸切除组每日皮下注射等量生理盐水(0.9%氯化钠的双蒸水)，治疗共12周。所有实验期间大鼠均饲养在23 ℃恒温条件下12 h光暗循环的房间中，且所有大鼠都可以自由饮水和标准的啮齿动物饮食。治疗结束后，处死所有大鼠。当大鼠处于麻醉状态时通过心脏穿刺收集血液，并收集左侧胫骨进行分析。

1.2 Micro-CT扫描

通过Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-MicroCT，Kontich，比利时)将每组5只大鼠用于测量胫骨近端中的小梁骨结构。在相同条件(分辨率：18 mm，源电压：65 kV，源电流：385 μA，旋转步骤：0.7°)下扫描所有骨骼。对整个胫骨进行扫描，并且对每个Micro-CT平扫图像绘制骨小梁区域。扫描后，将Micro-CT图像数据传输到工作站，并通过Micro-CT系统中的软件进行分析。评估骨小梁微结构的以下参数，如骨密度(bone mineral density，BMD)，骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目和骨小梁分离度，具体操作步骤参考文献[9]。

1.3 骨转换指标检测

收集的血液以3000 rpm离心10 min以提取血清。它被存储在-20 ℃冰箱中直到分析。 根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附通过中国武汉精细生物技术有限公司提供的试剂盒检测血清1型前胶原氨基末端前肽(type 1 procollagen amino terminal propeptide，P1NP)和I型胶原羧基端肽(type I collagen carboxy terminal peptide，CTX-1)浓度的水平。

1.4 骨生物力学检测

将包裹在氯化钠中的右侧胫骨进行生物力学测试。将样品放置在37 ℃±0.9%氯化钠中12 h，然后进行测试。对每个样品在8874型号力学机进行三点弯曲测试(美国马萨诸塞州诺伍德的Instron公司)，主载荷跨度为14.5 mm。以0.1 mm/s的位移速率将骨载荷至出现骨折，并测量载荷和位移。测试后，计算机记录载荷-位移曲线，从载荷-变形曲线计算极限载荷(N)，能量(J)和刚度(N/mm)。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠骨密度的改变

图1 各组大鼠手术12周时胫骨骨密度注：和Sham组比较，*P<0.05；和CON组比较，#P<0.05。Fig.1 Tibia bone density at 12 weeks after surgery in all groups

手术及治疗12周，3组大鼠胫骨的骨密度见图1，切除睾丸后12周，CON组较Sham组大鼠的骨密度显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；术后使用雷公藤治疗的LGT组其骨密度较CON组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；这表明雷公藤对去睾丸雄性大鼠的骨密度有一定的保护作用。

2.2 Micro-CT检测结果

手术12周时大鼠的胫骨Mciro-CT扫描结果见图2，微观参数见图3。与Sham组相比， CON组的胫骨骨量和小梁厚度显著降低(P<0.05)；CON组的小梁间距增加(P<0.05)，而LGT的上述指标明显优于CON组，差异有统计学意义(P<0.05)。骨组织形态计量学参数显示，LGT对去卵巢大鼠胫骨骨量有保护作用。

图3 治疗12周后大鼠胫骨微观参数比较注：和Sham组比较，*P<0.05；和CON组比较，#P<0.05。Fig.3 Microscopic parameters of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.3 生物力学性能

生物力学测试获得的数据见图4，Sham组具有最高的极限载荷、能量和刚度；与CON组比较，LGT组极限载荷、能量和刚度明显增加，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 治疗12周后大鼠胫骨Micro-CT扫描结果Fig.2 Micro-CT scans of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.4 治疗后大鼠血清CTX-1和P1NP的影响

治疗后大鼠血清CTX-1和P1NP的变化见图5。与Sham组比较，CON和LGT组的CTX-1和P1NP显著增加(P<0.05)。 LGT组的CTX-1和P1NP较CON组明显降低，比较差异有统计学(P<0.05)。

3 讨论

图4 治疗对大鼠股骨生物力学的影响注：和Sham组比较，*P<0.05；和CON组比较，#P<0.05。Fig.4 Effects of treatment on femur biomechanics

图5 治疗对大鼠血清CTX-1和P1NP的影响注：和Sham组比较，*P<0.05；和CON组比较，#P<0.05。Fig.5 Effects of treatment on serum CTX-1 and P1NP.

在目前的研究中，本研究结果表明腹腔注射雷公藤内酯能够抑制破骨细胞，从而防止老年大鼠胫骨骨质流失和改善小梁微结构。老年性骨质疏松症正在成为一个公共卫生问题，因为它导致脆性骨折增加，并伴随高昂的医疗和社会经济成本，亟需有效的策略来对抗这种疾病。然而，与年龄相关的骨丢失和微结构退化的潜在分子机制仍然知之甚少。许多年龄相关的变化与炎症状态的升高相关，炎症状态的升高表明炎症细胞因子水平升高，如TNF-α和IL-6。此外，以前的研究表明，炎症在年龄相关性骨丢失的病理学中也发挥重要作用[10]。更高的循环C-反应蛋白被认为是全身炎症的敏感标志物，与老年女性的骨密度降低相关[11]。此外，许多促炎细胞因子如IL-1和IL-6被证明具有促进破骨细胞分化、活化和骨吸收的能力[12]。此外，流行病学研究显示，在各种炎症条件下发生骨质疏松症的风险增加。上述结果支持炎症显著促成老年性骨质疏松症发病机理的理论。因此，抗炎可能是治疗老年骨质疏松症的潜在治疗靶点。雷公藤内酯是一种炎症抑制剂，其抗炎活性已有文献报道。由于这种抗炎性质，雷公藤内酯被广泛用于治疗各种疾病，如类风湿性关节炎、肾病综合征和癌症。巧合的是，这些疾病与骨质流失有关，导致患者出现额外的并发症。因此，研究雷公藤甲素对骨骼的影响是有意义的。

一些体外研究显示，雷公藤内酯具有抑制破骨细胞分化和功能的作用[8]。此外，以前的研究还表明，雷公藤内酯醇能够通过抑制胶原诱导的小鼠中的破骨细胞分化和形成来预防骨质破坏和骨吸收[8]。另外，雷公藤内酯被证明具有减弱钛颗粒诱导的骨溶解的能力[8]。以上结果表明雷公藤甲素可能对预防骨质流失有潜在的作用。然而，就笔者所知，本研究首先揭示了雷公藤内酯在预防雄性大鼠去除睾丸复制的骨丢失和改善骨结构的有益作用。为了确定骨重塑中的变化是否可以解释雷公藤内酯对去除睾丸所致骨丢失的保护作用，笔者对胫骨进行了Mirco-CT分析。在本研究中，雷公藤甲素对骨小梁有显著的影响。本研究确定雷公藤对去除睾丸所致雄性骨质疏松症大鼠骨丢失确切的保护作用。

同时，用雷公藤内酯醇治疗后，破骨细胞活性显著降低，从骨代谢指标CTX-1和P1NP水平降低可以反映。这些结果与有些学者的研究结果一致，表明雷公藤内酯能够抑制钛颗粒介导的骨溶解大鼠模型中的破骨细胞活性。一般认为骨质疏松症由于破骨细胞和成骨细胞的活性之间的失衡而发生骨丢失。因此，本研究表明雷公藤内酯促进胫骨骨密度，增加骨强度，并可能通过抑制破骨细胞活性改善大鼠骨组织。本研究显示，雷公藤甲素具有抑制破骨细胞活性的能力。尽管雷公藤内酯被证明对许多疾病具有许多药理学作用，但其相关的不良反应使其不能在临床实践中广泛使用。然而，越来越多的研究表明雷公藤内酯诱导的毒性取决于剂量和给药时间。研究报道，体内雷公藤内酯的最小毒性剂量为28 d为50 μg/(kg·d)或49 d为40 μg/(kg·d)[13]。本研究中使用的雷公藤内酯剂量为15 μg/(kg·d)，84 d，低于最小毒性剂量。因此本研究中使用的雷公藤甲素剂量为15 μg/ (kg·d)，84 d可能被认为是中等和安全的。

总之，在大鼠模型中，雷公藤内酯醇以15 μg/(kg·d)的剂量持续84 d似乎对于治疗性腺功能下降相关的骨丢失是安全和有效的。此外，雷公藤内酯的骨保护作用似乎部分通过降低骨转换来介导的。基于目前的研究，雷公藤内酯可能具有治疗老年男性骨质疏松症的潜力。