夹心ELISA法对奶牛早期妊娠的诊断及注意事项

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(1.湖南农业大学动物科技学院，长沙 410128；2.上海奶牛育种中心有限公司；3.光明牧业有限公司)

奶牛在怀孕后体内会生成一种妊娠蛋白，这种蛋白称为妊娠特异性蛋白B(PSPB)。它是由胚胎分离得到的几种天冬氨酸蛋白酶家族的混合物。1987年Garth.Sasser教授发现[1-2]，PSPB可用作牛羊等反刍动物早期孕检的有效标记物，然而它只有当奶牛怀孕时才会释放。随着配种时间的延长，这种蛋白在体内的浓度将越来越明显，尤其是在怀孕后的28 d至33 d，这种蛋白的浓度值达到高峰。优孕凯斯(BioPRYN)是一种使用抗原捕捉(夹心)，酶联免疫吸附法(ELISA)检测牛只血清中妊娠特异性蛋白 B(PSPB)的早期妊娠诊断技术。其原理是牛血清中的 PSPB 结合包被孔中的抗体(兔IgG 免疫血清)，用标记结合的二抗进行检测，最后通过颜色变化与酶标仪读数进行定量分析。夹心ELISA灵敏度高，特异性强，空怀检出率高。根据光明牧业有限公司旗下牧场近两年86775头份奶牛的数据统计分析，其空怀检出率可达99.55%。虽然空怀检出率很高，但依然存在许多问题，采样时间，采样手法以及在实验过程中操作不当等都可能造成假阳性的结果。因此本文主要介绍夹心ELISA在奶牛早期妊娠诊断中的应用及操作过程中的注意事项，为降低假阳性的风险提供理论基础。

1 实验前处理

1.1 样品采集 采集配种后28 d至33 d的奶牛尾根静脉血。采血量应控制在3～5 mL，不得少于2 mL，以防剂量不足，错过最佳检测时间。另外，采集完的血样应当场贴好标签，注明管号和牛号，放入-6℃冷藏保存，尤其夏季温度较高，在寄送实验室检测前必须放入冰袋以防采集的血液变质，送检单单独存放随样品一同寄出。

1.2 样品制备 实验室收到血样后，仔细核对血样编号与送检单，若出现样本上的牛号与送检单上牛号不一致，需在送检单上用红色水笔注明管上牛号，实验室所有检测牛号都以血样牛号为准。确认无误后将全血采血管放入3000转速的离心机中离心5 min。取上清液1～1.5 mL到2 mL离心管(离心管由管号+牛号组成，与采血管相对应)。

2 实验

2.1 材料与设备

2.1.1 仪器Thermo FC型号酶标仪(带有600 nm波长滤光片)；37 ℃ 或者20 ℃恒温箱一台；

2.1.2 移液器50.0～200.0 μL单枪头移液器；50.0～300.0 μL多通道移液器；及配套移液枪头若干；

2.1.3 辅助用品封口膜若干；移液槽5～6个；吸水纸巾；

2.1.4 试剂美国“优孕凯斯”早孕诊断试剂盒；质控剂。

2.2 操作步骤

2.2.1 回温实验前回温(20～25 ℃)所需的试剂盒、微孔板和样品。使用前需将所用试剂摇匀。

2.2.2 ELSIA板操作 在所有测试孔中加入样品缓冲液。其次加入标准品和测试样品。标准品做重复样，按照纵向排列的顺序依次加入，第二列开始直至倒数第二列纵向依次向下加入待检血清，最后一列留加质控样，对比每次实验结果的准确性。每种溶液加样时均使用一次性清洁的枪头，不可二次使用，避免交叉污染造成假阳性或者假阴性。加板结束用封口膜将微孔板密封以防蒸发，在20℃或37℃的培养箱孵育1 h。1 h孵育后，移去封口膜，洗板4次，在纸巾上拍干，使用多通道的移液器在所有孔中加入200 μL快速检测液(QUICK Detector)。用封口膜盖住板子，在室温下(20 ℃)孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。1 h后倒出结合溶液，洗板2次，在纸巾上拍干后每孔中加入200 μL的增强液(Enhancer)。用封口膜盖住板子，20 ℃下孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。

若出现加样颜色不一致，请务必换一把多通道移液枪，这是用枪不规范造成的移液枪污染，属人为原因，并非试剂原因。1 h后洗板4 次，加入200 μL TMB底物溶液到每个孔中。加TMB时，确保无菌，以避免剩余试剂污染导致检测结果的准确性。另外TMB易被氧化，所以在使用前务必要避光保存。15 min孵育结束后在所有孔中加入终止液，用手轻轻地拍打微孔板的周边，使其内容物均匀的混合在一起。加终止液的顺序要与加TMB的顺序一样，保证反应时间的一致性。全部试剂加完后眼观可以做初步的判断，蓝色为怀孕，黄色为空怀，而较浅的颜色需要读OD值才能确定。

2.2.3 读数与分析 在加样后30 min内将微孔板放在600 nm左右波长的酶标仪上读数。将酶标仪读出OD值数据导入分析软件COWPIE，输入牛号(图1)，系统会自动生成标准曲线并计算出R2值。实验成立的条件是标准曲线R2值必需大于0.985(图2)。生成报告前，选择正确的Multiplier 系数：

BioPRYN QK: 大于3 h的样品孵育，Multiplier系数

BioPRYN QK: 小于3 h的样品孵育，Multiplier系数

此外，标准品W 的OD 值必须大于0.4 才被认为有效。

(W的OD值>X的OD值>Y的OD值>Z的OD值)R2≥0.985。

图1 牛号输入反馈图

图2 标准曲线图

根据曲线，每个样品的OD值会经过最小二乘法回归(LSG)转化成标准化的结果。离群值已经过调整成符合回归方程的值。转化后的结果值与已确定的临界值进行比较(参考表1)，将每个样品的结果进行归类。结果以标准化的BioPRYN来显示(图3)。

血液早孕检测属于实验室检测，该诊断方法相比B超诊断变异小，影响因素少，不同的实验操作人员按照操作规程进行检测，其准确性都是一致的[3]。所以系统测出的怀孕与空怀进一步与板上的显色反应进行核对，会发现其结果与颜色是一一对应的。若有不同，肯定是操作不慎造成，需在该牛号旁边标注，以备下次复检待用。

表1 标准化的OD值分类结果表

图3 软件分析后标准化结果图3 实验后处理

实验完成后，将试剂盒放置冰箱冷藏(4～8 ℃)，切不可放置实验台贮存，更不能放在阳光直射的地方。特别注意的是冬天温度较低，为避免试剂冰冻影响试剂的正常使用，需将冰箱冷藏的温度适当调高。另外，每次实验后都应用新洁尔灭按1∶14的比例配制消毒水对实验操作台进行消毒灭菌。把实验服放消毒水中浸泡3～4 h，一个星期浸泡一次，有条件可每日浸泡，这是对环境的要求，更是为了检测员自身及他人的生命健康。因此，做好各项消毒防范措施是每个检测员应尽的职责。

4 小结

目前，夹心ELISA在奶牛早期妊娠诊断技术上已越来越成熟，特别是与传统B超或直肠检查相比，显示出了其独特的优势。该项诊断技术灵敏度高，特异性强，不仅提高了繁殖率，而且也减少了牛只的应激，对空怀牛只的检出率更是接近于100%。但在采样和操作环节，仍然需要谨慎操作，以防不正当的行为导致实验结果假阳性，影响配种时间。特别是假阴性，后果更是不堪设想。因此，我们必须利用好这项技术才能更好的为牧场服务。