大鼠下腔静脉型巴德-吉亚利综合征动物模型的制备

方伟伟，成德雷，吕维富*，朱 楠，陈晓明，刘开才

(1.安徽医科大学附属省立医院影像科，安徽 合肥 230001；2.安徽省五河县人民医院影像科，安徽 蚌埠 233300；3.安徽医科大学第二附属医院消化科，安徽 合肥 230601)

巴德-吉亚利综合征(Budd-Chiari syndrome, BCS)是肝静脉(hepatic vein, HV)和/或其开口以上的下腔静脉(inferior vena cava, IVC)阻塞，导致门静脉(portal vein, PV)和/或IVC高压的临床症候群[1]，根据阻塞部位可分为HV阻塞型、IVC阻塞型和混合型[2]，西方国家以HV阻塞型BCS较常见，而亚洲国家则以IVC阻塞型为主[3-4]。目前有关BCS的相关基础研究及动物模型造模研究相对较少[5-7]。本研究通过部分结扎大鼠肝后段IVC建立IVC阻塞型BCS模型，旨在为BCS研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1实验对象 健康成年雄性SD大鼠36只[购于安徽省立医院实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2005-0001]，体质量185～235 g。普通饲料喂养。饲养环境：室温15℃～25℃，湿度50%～60%，保持饲养室良好通风及洁净。采用随机数字法将其均分为模型组和对照组，每组18只。本研究经安徽医科大学动物伦理委员会批准。

1.2模型制备 术前实验鼠停饲1日(不停水)。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体质量)腹腔注射麻醉动物，腹部备皮后保定于实验台，常规消毒、铺巾。取剑突下腹部正中切口，逐层进腹后分离镰状韧带，下压肝脏暴露肝后段IVC，游离IVC，将3F微导管(泰尔茂)平行紧贴IVC，并以0号线环绕扎紧后抽出微导管，关腹前给予青霉素每只20 U腹腔灌洗，再逐层缝合，术后连续5天肌肉注射青霉素每只20 U。对照组暴露而不结扎IVC，其余步骤同模型组。术前和术后处死前每日称取大鼠体质量。

1.3肝功能指标检测 于术后第28天以眼眶后静脉丛采血法取1～2 ml静脉血，检测肝功能指标，包括谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酰转移酶(glutamyltransferase, GGT)、白蛋白(albumin, ALB)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。

1.4影像学检查

1.4.1超声检查 术后第84天，停饲8 h后对大鼠进行腹部超声检查，记录肝脏和脾脏大小、形态、内部回声，观察HV、PV和IVC是否通畅、有无狭窄、有无肝内和/或肝外侧支形成。

1.4.2DSA检查 术后第85天，暴露大鼠任意一侧下肢股静脉，置入21G留置针，行DSA，观察IVC阻塞段及侧支静脉形成情况。

1.5病理检查 DSA后第2天，采用上述同样方法麻醉大鼠，开腹取大鼠肝脏、脾脏样本，采用游标卡尺测量脾脏长径、宽度及厚度，并用电子分析天平(Mettler Toledo PL403)称重。取肝左叶约1 mm×1 mm×1 mm组织块固定于2.5%戊二酸磷酸盐缓冲液，以透射电镜(JEM-1230型)观察肝细胞的细胞膜、细胞核、粗面内质网、光面内质网及线粒体等结构。取适量肝脏及脾脏固定于4%甲醛溶液，经石蜡包埋、切片，行常规HE染色，光学显微镜(Nikon 80i)观察肝脏、脾脏形态学改变。

1.6统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。计量资料以±s表示。采用独立样本t检验或t'检验比较2组大鼠体质量、脾脏质量，以及脾脏长径、宽度、厚度和肝功能指标；对2组组内术前和术后第7天、第21天大鼠体质量进行方差齐性检验，采用重复测量设计资料的方差分析进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1建模情况 模型组大鼠术中死亡1只，术后分别于第7天及第11天因感染死亡2只，余15只成功建模，建模成功率83.33%(15/18)。模型组大鼠生长缓慢，毛色灰暗无光泽；术后第3天9只出现对疼痛反应减低；术后第4天均出现活动减少、食欲减退、对外界刺激反应迟缓；术后第12～21天均出现体质量增加，

表1 模型组与对照组大鼠不同时间点的体质量比较(g，±s，n=15)

表1 模型组与对照组大鼠不同时间点的体质量比较(g，±s，n=15)

组别术前术后第7天术后第21天处死时模型组206.56±15.56207.73±15.54226.93±15.79290.40±28.88对照组209.11±11.49212.27±12.71215.93±13.30333.13±14.61t值0.830.764.2626.15P值0.580.390.048<0.01

图1 大鼠腹部超声 A.对照组大鼠肝脏体积不大，肝内回声均匀，肝周未见液性暗区，IVC未见明显狭窄; B.模型组大鼠脾脏周围可见液性暗区(箭)，脾脏肿大; C.箭示狭窄端IVC; D.肝内静脉形成交通支，血流丰富 (liver:肝脏;spleen:脾脏;IVC：下腔静脉)

腹部膨隆、腹壁紧张，于术后第15天随机抽取其中6只行腹腔穿刺，可抽出淡黄色液体；术后第28天开始大鼠腹部膨隆、腹壁紧张缓解，体质量降低。术后第86天处死时，大鼠腹腔内均可见淡黄色积液，3只可见明显胃肠道淤血、胀气扩张，7只可见腹壁浅静脉及腹腔侧壁静脉纡曲增粗。

对照组大鼠术中死亡1只，术后第6天死于感染1只，术后第10天不明原因死亡1只，余15只存活，死亡率16.67%(3/18)。15只大鼠术后前3天均对疼痛反应减低，后活动如常、饮食正常，反应机警，体质量呈逐渐增加趋势，未出现BCS相关症状。

2.2体质量变化 2组组内不同时间点大鼠体质量差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组术前、术后第7天大鼠体质量差异无统计学意义，术后第21天模型组大鼠体质量高于对照组，处死时对照组大鼠体质量高于模型组，见表1。

2.3肝功能情况 术后第28天，模型组大鼠ALT、AST、ALP、GGT、TBIL较对照组升高(P均<0.05)；而DBIL和ALB差异无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

2.4超声表现 模型组：肝、脾肿大，肝脏实质回声增粗，肝、脾周围和肠间隙可见明显液性暗区；肝内静脉淤血扩张并可见丰富肝内交通支；IVC阻塞，远端管腔不同程度扩张；12只结扎处IVC变窄，余3只结扎处IVC完全闭塞；IVC内有高回声血栓形成，血流充盈缺损，严重者腔内未见血流充盈；IVC周围可见新的侧支血管。对照组：肝、脾不大，内部回声均匀，腹腔未见液性暗区；肝内静脉无明显扩张、无交通支，IVC未见狭窄或扩张，血流通畅。见图1。

2.5DSA表现 模型组：IVC结扎处管腔明显变窄，狭窄段管径均<0.8 mm(狭窄率>80%)，对比剂线性通过，其远端管腔扩张，并可见腰升静脉开放，IVC血流通过侧支循环汇入上腔静脉，同时胸腹腔内侧壁曲张静脉可显影。对照组：IVC未见明显狭窄，回心血流通畅。见图2。

2.6病理学表现 大体病理：模型组大鼠肝脏呈暗紫色，以肝脏边缘较为明显，肝脏淤血肿大，被膜紧张，表面呈粟粒样改变，触之质韧，其中6只大鼠肝脏与膈肌粘连；对照组肝脏呈暗红色，表面光滑，质地柔软，其中3只大鼠肝脏与膈肌粘连。模型组和对照组脾脏长径分别为(36.80±2.90)mm和(30.60±1.96)mm(t=5.61，P<0.01)，宽度分别为(7.00±0.76)mm和(6.47±0.91)mm(t=1.74，P=0.93)，厚度分别为(3.93±0.70)mm和(3.73±0.80)mm(t=0.73，P=0.47)，脾脏质量分别为(0.68±0.10)g和 (0.37±0.27)g(t=9.15，P<0.01)。

表2 模型组与对照组大鼠术后第28天时肝功能情况(±s，n=15)

表2 模型组与对照组大鼠术后第28天时肝功能情况(±s，n=15)

组别ALT(U/L)AST(U/L)GGT(U/L)ALB(g/L)TBIL(μmol/L)DBIL(μmol/L)ALP(U/L)模型组112.58±14.96287.00±34.361.80±0.4734.48±3.512.45±0.351.59±0.63234.83±64.76对照组41.47±5.49130.40±19.091.25±0.4033.15±2.021.17±0.521.25±0.7163.93±18.00t值17.0915.033.311.237.321.299.80P值<0.01<0.010.030.23<0.010.21<0.01

图2 DSA表现 A.对照组，箭示大鼠膈下IVC，管腔未见明显狭窄及扩张; B.模型组，黑箭示膈下IVC明显狭窄，狭窄段管腔直径约0.8 mm，白箭示腰升静脉开放并汇入上腔静脉 图3 模型组病理图 A.肝细胞排列紊乱，正常肝细胞索消失，肝小叶中央静脉及其周围肝血窦扩张，其内可见大量红细胞淤积(HE，×200); B.肝小叶中央静脉周围肝细胞广泛脂肪样变性(HE，×400)

光镜下见模型组肝细胞索紊乱，肝细胞肿胀、脂肪样变性；较严重区域肝小叶结构消失，肝细胞坏死，炎性细胞浸润，中央静脉及肝血窦扩张、淤血，汇管区纤维增生和轻度纤维化，尚无纤维间隔包绕形成假小叶(图3)；脾脏见脾窦轻度扩张，窦内皮细胞增生，脾小体萎缩；对照组肝细胞呈多面形，细胞核大而圆，核仁清晰；胞质丰富、呈粉红色；肝细胞相互连接成肝细胞索；脾脏未见异常。

透射电镜见模型组肝细胞局限性水肿，肝细胞内细胞器减少，线粒体嵴断裂或空泡变性，肝细胞胞质内大量脂滴堆积，粗面及光面内质网扩张，周围线粒体减少，肝细胞核膜裂隙增宽；对照组大鼠肝细胞形态正常，内有丰富的线粒体、高尔基体，核膜清晰。

3 讨论

IVC阻塞型是亚洲国家最常见的BCS分型。既往汪海军等[6]采用外科手术缩窄家兔HV主干制备BCS动物模型；王春喜等[8]利用介入技术制备HV阻塞型BCS动物模型，对设备、技术要求高，成本亦高，不能高度模拟IVC阻塞型，且选择性阻塞HV可导致相应肝叶缺血坏死、萎缩，其余肝叶代偿性增大，不能很好地模拟BCS的自然病程发展过程。

本研究借鉴Akiyoshi等[9]的方法制备IVC阻塞型BCS，建模成功率83.33%。术中选用3F微导管代替玻璃棒，可避免完全结扎IVC造成的急性肝功能衰竭，且微导管柔顺性较好，还可避免术中造成气胸或肝脏损伤。此法制备IVC阻塞型BCS模型成本低，所需器械、试剂及药品易于获得；大鼠为常用实验动物，易获得、造价低，且易饲养，管理方便；其肝脏解剖结构与人类相似度较高，动物模型模拟性强；术中操作简单，便于推广及大批量造模，所获模型可高度模拟我国多发型BCS疾病类型。

建模后第12天始，模型组大鼠体质量逐渐增加，腹部穿刺抽出淡黄色液体，提示腹腔积液形成：PV压力升高时，腹腔内脏血管床静水压升高，组织液回收减少而漏入腹腔，从而形成腹腔积液。建模后第28天始模型组大鼠腹腔积液逐渐减少，与肝内交通支及周围侧支静脉形成有关：腹部超声证实肝内静脉出现广泛交通支，下腔静脉DSA发现腰升静脉开放，病理见腹壁及腹腔内侧壁浅静脉纵行纡曲、扩张，与BCS患者腹部静脉曲张形成原因类似，均为IVC阻塞后导致IVC高压症候群。建模后模型组大鼠食欲减低，与胃肠道血流回心受阻、胃肠道淤血有关。出现大量腹腔积液时，上述症状加重，导致模型组大鼠生长缓慢。

术后第28天，模型组大鼠ALT、AST、ALP、GGT及TBIL较对照组升高，提示长期肝脏淤血造成肝细胞损伤，肝、脾大体标本及电镜观察均可见相关表现。部分结扎IVC后，HV回心血流受阻，淤血从肝小叶中心静脉开始一直扩展到肝血窦，长期肝脏血流回流不畅可致肝内PV、HV和肝动脉血液循环失衡，造成肝细胞缺氧和养料供给障碍，进而发生非炎性坏死，炎性细胞浸润，汇管区纤维增生并形成纤维分隔。

我国多数BCS患者主要以腹腔积液、胸腹壁静脉曲张和肝脾肿大等症状就诊[10]。本研究所制动物模型均存在腹腔积液、胸腹壁静脉曲张和肝脾肿大等PV及IVC高压症候群，与BCS临床表现相似；影像学检查显示大鼠IVC及HV血液回流受阻，IVC管径狭窄甚至闭塞，同时见侧支循环开放，与临床IVC阻塞型BCS相类[11]。

综上所述，部分结扎大鼠肝后段IVC所建立的IVC阻塞型BCS动物模型可较好地模拟IVC阻塞型BCS患者的临床表现及病理生理改变。