三种激素性股骨头坏死造模影像病理学比较研究*

李兴国，赵道洲，张 磊

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

激素性股骨头坏死是临床常见的致残率较高的骨科疾患。随着激素类药物在临床、食物中的广泛应用，激素性股骨头坏死的相关报道屡见不鲜，且发病年龄趋于年轻化。激素性股骨头坏死来院就诊时大多已经出现股骨头及髋关节变形，不得不进行人工关节置换［1］。当前，激素性股骨头坏死的防治已成为世界性的医学课题。早诊断，积极保头的治疗可免于或者延迟人工髋关节置换术［2-3］。因此，国内外学者用不同的方法建立SANFH模型，进而从分子、基因等方面对发病机制进行了深入研究［4］。本研究复习文献选择常用且不同的3种造模方法：单纯激素法、内毒素加激素法和马血清加激素法，建立不同的激素性股骨头坏死模型，从影像学、组织病理学方面进行研究，比较出典型的、接近临床的兔激素性股骨头坏死模型，并进一步研究激素性股骨头坏死的发病病因及发病机理。

1 材料与方法

1.1 动物 同龄、健康新西兰大白兔48只，雌雄各半。新西兰大白兔来自中国农业科学院兰州兽医研究所，实验动物许可证号：SCXK(甘)2010-0001。

1.2 主要试剂及仪器 大肠杆菌内毒素(LPS，美国Sigma公司生产，国药准字S10820320，规格：25 mg/瓶)；甲基强的松龙(MP，上海罗氏公司，批号：H20030727，规格：500 mg/ 瓶)；地塞米松磷酸钠注射液(DXM，天津药业焦作有限公司，国药准字H41020036，规格：10 mL/支)；马血清(上海卓康生物科技有限公司，国药准字S10910131，规格：200mL/瓶)；庆大霉素［天津药业焦作有限公司，国药准字H41020089，规格：20 mL(80万 U)/支］；戊巴比妥钠(上海试剂二厂，批号：810923)。实验室为兰州军区兰州总医院骨科研究所实验室。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及饲养 48只同龄健康新西兰大白兔于兰州军区动物饲养科饲养。动物适应性喂养1周后称重，以体质量按随机数字表法随机分为 4组：A组(空白组)、B组(单纯激素组)、C组(内毒素加激素组)、D组(马血清加激素组)。各组雌雄不限，体质量2.2～3.0 kg，均在同一条件下室内单笼饲养，进食普通饲料，温度(20±2)℃，湿度50%。实验过程中动物处置符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见［5］。

1.3.2 造模 A组(空白组)与其他组同时间点注射等量生理盐水；B组(单纯激素组)同时间点兔双侧臀肌注射地塞米松(DXM)2.5 mg/(kg·d)，连续注射9周；C组(内毒素加激素组)第1天于兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS)20 μg/kg，间隔24小时再次注射LPS，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙20 mg/(kg·d)，共3次，间隔24小时。每次注射前均重新称重后计算剂量。D组(马血清加激素组)兔耳缘静脉注入马血清共10 mL/(kg·次)，共2次，间隔2周。第2次马血清注射后2周，再连续3天臀部注射甲基强的松龙 40 mg/(kg·d)［6］。所有动物臀部肌注庆大霉素每天8万U，连续1周，以预防感染。

1.4 观察指标

1.4.1 一般行为学 一般形为学观察包括动物活动度、体质量、尿量、精神、毛发光泽度等。后期病理切片取材时观察股骨头外观。

1.4.2 X线检查 D组兔最后1次注射完甲基强的松龙次日计为所有动物实验开始第1日。第3、6、9周各组兔子以3%戊巴比妥钠12 mg/kg耳缘静脉注射麻醉后拍摄X线片，主要观察兔股骨头X线平片变化情况，对X线平片进行定性评价：包括股骨头形态、密度、骨小梁结构及骨皮质连续性等。

1.4.3 组织病理学 将第3、6、9周各组随机抓取的2只兔子以空气栓塞法处死后，手术取出双侧股骨头，由基底部沿正中冠状面将股骨头劈开，立即4%多聚甲醛液固定48小时，10%乙胺四乙酸二钠(EDTA)脱钙1～2周，流动水冲洗24小时，系列酒精脱水，常规石蜡包埋，4 μm层厚切片，行HE染色。光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析数据，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，各组间效应差异应用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为学 A组：正常饮食，体质量渐增。B、C、D组动物注射药物后出现精神萎靡，活动及饮食饮水次数减少，反应淡漠，并出现畏寒喜蜷缩，双耳下垂，部分动物流涕，部分出现腹泻，动物于末次注射后3周明显消瘦，体质量减轻。A组动物于末次注射后4周体质量增加，注射中有1只动物死亡。B组注射中有3只动物死亡；C组末次注射后10天内有5只动物死亡，D组末次注射后10天内有4只动物死亡。实际进入统计的实验动物为A组11只，B组9只，C组7只，D组8只。4组新西兰大白兔造模前及造模后体质量比较结果见表1。

表1 各组动物实验前后体质量比较(±s) kg

表1 各组动物实验前后体质量比较(±s) kg

注：△表示与空白组比较，P＜0.01；▲表示与单纯激素组比较，P＜0.05

组别 只数 实验前 实验后空白组(A) 11 2.24±0.83 2.55±0.81单纯激素组(B) 9 2.26±0.94 1.82±0.74△内毒素加激素组(C) 7 2.23±0.68 1.81±1.01△▲马血清加激素组(D) 8 2.27±0.89 1.79±0.91△▲

由表1可见，1)实验前各组间兔体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明分组时遵守组间均衡一致的原则；2)实验结束时，空白组兔体质量明显增加，与其他3组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，证明激素对兔体质量有较大影响；3)C、D组与B组比较，结果表明：内毒素和马血清组对兔体质量影响与单纯激素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；4)C、D 2组间比较毒素和马血清对兔体质量影响差异无统计学意义(P＞0.05)。2.2 X线检查 各组兔子于第3、6、9周以3%戊巴比妥钠12 mg/kg耳缘静脉注射麻醉后拍摄X线片。A组：双侧髋关节间隙正常，无关节面塌陷等情况，骨小梁清晰可见，骨质正常，无骨质疏松等异常表现(见图1)。B组：第9周时关节间隙稍狭窄，骨质轻度疏松(见图2)。C组：第6周时关节间隙稍狭窄，骨质疏松明显(见图3)；第9周时关节间隙明显变窄，骨质疏松加重，并伴有轻度骨小梁模糊不清(见图4)。D组：第6周时关节间隙狭窄，骨质疏松明显，并伴有轻度骨小梁模糊不清(见图5)。第9周时关节间隙狭窄更加明显，骨质疏松加重，可见股骨头模糊不清(见图6)。

图1 A组第9周时的正常X线片

图2 B组第9周时X线片

图3 C组第6周时X线片

图4 C组第9周时X线片

图5 D组第6周时X线片

图6 D组第9周时X线片

2.3 病理学检查结果 第3、6、9周时手术取出各组动物股骨，于股骨头基底部将股骨头分离，沿正中冠状面将股骨头劈开，立即4%多聚甲醛液固定48小时，10%EDTA脱钙1～2周，系列酒精脱水，常规石蜡包埋，4 μm层厚切片，行苏木精-伊红染色(HE)染色。光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞的变化。A组：股骨头软骨厚度均匀一致，软骨细胞排列整齐；骨小梁结构完整、粗壮，排列规则整齐，致密饱满，骨陷窝内骨细胞形态正常，骨细胞清晰可见，核较大、位于中央，骨髓腔增生活跃，造血细胞丰富，骨髓腔内脂肪细胞形态正常(图7)。B组：第3、6周所取标本同A组，第9周股骨头形态基本正常股骨头软骨稍薄(图8)。C组：第3周取材切片同A组。在第6、9周于股骨头干垢端即股骨头与股骨颈交界的应力区可见部分骨小梁断裂，有软骨破坏，无股骨头表面塌陷等情况，第9周脂肪变性加重及坏死骨组织扩大(图9)。D组：第3周取材同A组。在第6、9周见股骨头形态完整，股骨头软骨面有轻度毛糙，稍欠光滑，略呈灰白色。无软骨缺损及股骨头表面塌陷等情况(图10)。

图7 A组病理学检查结果(HE×40)

图8 B组病理学检查结果(HE×40)

图9 C组病理学检查结果

图10 D组病理学检查结果(HE×10)

3 结论

经过激素性股骨头坏死3种模型方法的比较分析发现，内毒素加激素组和马血清加激素组两种方法均成功实现了造模。其中依据病理切片通过骨组织形态比较［7］发现以内毒素加激素组造模出现坏死征像较早，马血清加激素组次之，单纯激素未获得成功。

从实验周期看，马血清加甲强龙组造模前需要注射2次马血清，中间间隔2周，再持续注射甲基强的松龙3次，造模前准备总计17天。内毒素加甲基强的松龙组造模前准备总计7天。造模6周后内毒素加激素组56%、血清加激素组67%出现股骨头坏死，而动物死亡率分别为42%(5/12)，33.33%(4/12)。Matsui等［8］模型中未提及动物死亡率，Kabata等［9］模型中动物死亡率为40%(8/20)。不考虑该实验动物的种群胆小怕惊吓致死等个体差异因素［10］，动物死亡率偏高，与其他报道一致。实验兔子来源广泛，易于饲养和管理，兔子寿命相对较长可做长期药理药物实验，重复性高。

如何增加兔模型下肢负重［11］，或者增加兔髋关节机械压力，加速造模，提高造模成功率，为后期实验研究提供保障。股骨头坏死的生物力学影响因素越来越受到人们的重视。因此基于动物模型，结合激素模仿人体生物力学的研究显得十分必要。在今后研究中可尝试运用小剂量低频率，大剂量低频率等方法以降低成本，节省资金和人力资源。

本研究发现第3、6周均见股骨头形态光滑完整，股骨头表面软骨乳白色，无软骨缺损及股骨头表面塌陷等，情况同空白组。第9周股骨头形态基本光滑完整，股骨头软骨面色泽稍暗。股骨头病理切片检测示：第3、6周所取标本同空白组。第9周股骨头形态基本正常，股骨头软骨稍薄。在DR拍片检查中第3、6周同空白组，第9周时关节间隙稍有狭窄，骨质轻度疏松。单纯激素组未能诱导出激素性股骨头坏死模型，部分学者认为采用其他方法联合造模可能与单纯激素造模在调节因子和酶类的蛋白表达等机制方面有所不同，有待进一步研究。

本研究中马血清加甲强龙组、内毒素加甲强龙组在第9周不论是股骨头大体标本观测还是股骨头病理切片检测以及DR拍片检查均符合激素性股骨头坏死的诊断标准。同时显示内毒素加激素组在血液系统检查、病理切片检查方面早于马血清加激素组，但部分指标2组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。内毒素加激素组和马血清加激素组均在6到9周出现了不同程度的股骨头坏死征象，证明2组造模可靠，可为药物试验提供良好的平台。