体外培育牛黄对慢性阻塞性肺疾病大鼠的保护作用研究※

刘 灵,白 丽,段瑞娴

(山西省中西医结合医院,山西 太原030000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)本质是气道慢性炎症。白介素-10(IL-10)是一种抑制性细胞因子,能够抑制气道中性粒细胞和肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,促进中性粒细胞凋亡,清除肺部炎症[1]。除了肺部的慢性炎症、蛋白酶失衡等在COPD发病中起重要作用外,细胞凋亡在COPD的发生、发展过程中也是应当重视的作用机制[2]。体外培育牛黄的性状、成分、药效与天然牛黄一致,具有抗炎、抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3]。目前国内外对体外培育牛黄治疗COPD的研究较少,本研究采用ELISA法测定大鼠血清IL-10的含量,通过TUNEL技术检测Ⅱ型肺泡细胞的凋亡,了解体外培育牛黄对COPD的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 分组及模型制备 将体质量(200±30)g清洁级健康雄性8周龄Wistar大鼠50只(购于山西医科大学动物实验中心,许可证号:晋SCXK 2015-0001)适应性喂养2周后,按照随机数字表法分为空白对照组(A组),COPD模型组(B组)、牛黄干预组(C组)、布地奈德(激素)干预组(D组)、牛黄+激素干预组(E组),各组动物的饲养条件相同。B、C、D、E组制备COPD模型[4]。制备2 mg/mL脂多糖溶液[10 mg脂多糖(北京索莱宝科技有限公司)溶解于5 mL 0.9%氯化钠注射液中],分别于第1、15日注入B、C、D、E组大鼠气道内,被动吸烟(每日2次,每次间隔2 h,每次点燃12支香烟)。A组:第1、15日在大鼠气道内注入0.1 mL 0.9%氯化钠注射液。C组:在每次烟熏前1 h给予体外培育牛黄(武汉健民大鹏药业有限公司,国药准字Z20030011)灌胃(将1.5 g体外培育牛黄溶解于6 mL蒸馏水中,配成浓度为250 mg/mL溶液)。D组:在每次烟熏前1 h给予雾化吸入布地奈德(AstraZeneca Pty Lt d)1 mg/d。E组:在每次烟熏前1 h给予体外培育牛黄灌胃(800 mg/kg)和雾化吸入布地奈德1 mg/d。4周后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。

1.2 标本采集及制备

(1)将成功麻醉的大鼠固定于解剖台上,打开胸腔,心脏取血5 mL,离心分离血清,置于-20℃冰箱中保存。采用ELISA法测定血清中IL-10含量,试剂盒购置于武汉博士德生物。按照ELISA试剂盒说明书操作。

(2)取右肺上叶约1.0 c m×1.0 c m×0.2 c m标本,用0.9%氯化钠注射液冲洗干净,置于中性甲醛液中固定24 h,常规石蜡包埋,应用TUNEL法检测Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡。

1.3 TUNEL法检测 试剂盒购置于武汉博士德生物。①严格按照说明书完成实验步骤。②结果判定:镜下细胞核中为棕黄色颗粒的即为凋亡细胞。在400倍光镜下随机选取10个视野,再随机观察100个Ⅱ型肺泡上皮细胞,凋亡细胞数目/100表示凋亡指数,再计算平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据统计。计数资料以均数±标准差)表示,多组资料进行方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察 A组大鼠活泼好动,食量正常;呼吸平稳,呼吸道无分泌物,未闻及痰鸣音。B、C、D、E组大鼠逐渐出现蜷伏少动,撮毛,食量减少,毛发黄、易脱落,体重较A组减轻;呼吸急促,呼吸道有分泌物从口鼻流出,偶可闻及咳嗽及气道痰鸣音,随着造模时间的延长,上述症状逐渐加重。

2.2 大鼠肺组织病理切片观察 A组:肺泡结构正常。B组:可见支气管纤毛部分脱落,大量炎性细胞浸润,肺泡腔扩大,肺大泡。C组:局部肺泡扩张、融合,可见少量炎性细胞浸润,但肺泡融合程度、炎性细胞浸润和肺泡间隔断裂等方面较B组减轻。D组:局部肺泡扩张、融合,可见少量炎性细胞浸润,但是肺泡融合程度、炎性细胞浸润和肺泡间隔断裂等方面较B组减轻。E组:少量炎性细胞浸润,肺泡间隔断裂及肺大泡的形成比B、C、D组大鼠明显减轻(图1见本期第117页)。

2.3 IL-10检测结果 与A组比较,其他各组大鼠的IL-10含量增高,差异均有统计学差异(P＜0.05);5组大鼠IL-10含量多重比较,除C组和D组比较无统计学意义外(P＞0.05),其余各组比较组间差别有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组COPD大鼠血清IL-10含量比较

2.4 TUNEL测定Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡指数TUNEL染色显示细胞核内含有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞(图2见本期第117页)。与A组比较,B、C、D、E组大鼠的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡指数显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);5组大鼠的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡指数多重比较均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡指数比较

表2 各组COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡指数比较

注:与A组比较,▲P＜0.05;与B组比较,◇P＜0.05;与C组比较,★P＜0.05;E组与D组比较,△P＜0.05

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3 讨论

COPD患者IL-10含量降低及其调控分泌的促炎症细胞因子的增加可能是气道持续炎症并导致气道重塑、气流受限、肺组织破坏等病理过程的重要机制[5]。而以肺结构细胞凋亡为特征的肺气肿改变是导致患者肺残气量增加、肺顺应性下降等肺功能减退的主要病理基础[6]。TUNEL法对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征[7]。体外培育牛黄是在仿生学技术基础上模仿牛胆内的生物环境研制而成,体外培育牛黄对急性炎症的渗出和慢性炎症的增生及结构细胞凋亡均有显著的抑制作用,还能提高机体耐缺氧能力,所以推测体外培育牛黄可能对COPD也具有保护作用[8-9]。

吸烟和感染是引起COPD发病最主要的环境因素。笔者对大鼠进行烟雾刺激并注射脂多糖诱发感染以模拟其病理生理过程,4周后模型组病理改变结果与文献报道一致,符合COPD病理的特征性表现。本研究结果中5组大鼠血清中IL-10含量多重比较,除C组和D组相互比较无统计学意义外(P＞0.05),其余各组比较组间差异均有统计学意义(P＜0.05),提示体外培育牛黄可以降低COPD的炎症反应并减轻肺组织的病理损害。本研究结果表明,COPD的发病与肺泡上皮细胞过度凋亡密切相关,而组间比较提示体外培育牛黄可以降低COPD模型大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡,与雾化激素联合作用更明显。但体外培育牛黄对COPD的保护作用的量效关系尚需进一步研究探讨。