QuEChERS-UPLC-MRM-IDA-EPI法测定巴比妥类药物的临床监测

涂凤莲，熊周芳，汪元符

（1. 新建区中医医院，江西 南昌 330100；2. 南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

巴比妥类药物是一组巴比妥酸的衍生物，能够抑制中枢神经系统而起到镇静的作用。还可增强γ-氨基丁酸（GABA）的作用，有效延长氯离子通道的开放时间，使细胞过度除极；在高浓度时，可以在没有GABA存在的情况下直接作用于GABA受体。巴比妥类药物主要在肝脏中代谢，部分药物未被转化可直接从肾脏随尿液排出。巴比妥类药物是使用最早最广泛的镇静催眠药物，大剂量使用可麻痹延脑呼吸中枢，进而抑制呼吸导致死亡。而且，此类药物还具有依赖性和成瘾性，同时治疗浓度窗相对较窄，很容易因为摄入过量而致死（曾被用于死刑注射，也常被自杀者所采用）。因此，巴比妥类药物的合理使用、用药监护显得尤为重要。通过文献检索[1-9]：以全血、尿液及其他（动物饲料、保健食品）基质为检材，己建立一系列巴比妥类药物检测方法，样品前处理一般采用液-液分配萃取（以乙醚为溶剂）或小柱固相萃取（SPE），仪器方法有液相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法、气相色谱-质谱联用（GC-MS/MS）法、离子迁移谱法等。本文以全血、尿液、唾液为检材，采用QuEChERS[原理与高效液相色谱（HPLC）和SPE相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的]提取方法处理生物样本，结合超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS），建立了QuEChERS-超高效液相色谱（UPLC）-多重反应监测（MRM）-条件触发（IDA Criteria）-增强子离子扫描（EPI）的检测方法，可同时定性与定量测定巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥等巴比妥类药物，为临床监测提供依据。

1 仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱仪，ekspert ultraLC100超高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，WH-3微型旋涡混合仪，Hettich Rotina 380R 1706型冷冻离心机，Reeko30位自动氮吹仪，Büchi Syncore 12位平行蒸发仪，KQ-300DB 型数控超声波清洗器，Thermo连续可调式精密移液器（20 μL～200 μL及 100 μL ～ 1000 μL），Millipore超纯水系统。

试剂：乙腈（色谱纯，Merck），甲酸铵（优级纯，阿拉丁），甲酸（优级纯，阿拉丁），无水硫酸镁（优级纯，阿拉丁），无水醋酸钠（优级纯，阿拉丁），无水硫酸钠（优级纯，阿拉丁），C18（粒度约80 μm，Agela），PSA（粒度约 60 μm，Agela），GC（粒度约 70 μm，Agela）。

标准物质：巴比妥（CAS：57-44-3，批号：171220），苯巴比妥（CAS：50-06-6，批号：171222），异戊巴比妥（CAS：57-43-2，批号：171221），均来源于中国食品药品检定研究院。

检材样品：全血（外周血）、尿液与唾液，方法建立采用来源于健康人体的样本，并监测了近两年来9例患者样本，患者年龄31～65岁，病情及诊断为失眠或癫痫，给药苯巴比妥，病例号：01463、12762、13497、26759、32079、91210、92568、92569、92581，对应编号为①～⑨，于给药后1 h采样。

2 方法与结果

2.1 超高效液相色谱分析条件

分析柱：Waters Atlantis T3 C18，100 mm×2.1 mm，3 μm。柱温：40 ℃。流速：0.2 mL/min。进样量：5 μL。流动相：A为含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸铵水溶液，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：负离子模式（ESI-）。扫描模式：多重反应监测（MRM）-条件触发（IDA Criteria）-增强子离子扫描（EPI）。扫描范围：50 Da～650 Da。气帘气压力：30 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：-4 500 V。离子源温度：500℃。雾化气压力：60 Pa。辅助气压力：55 Pa。界面加热状态：开启。离子对选择见表2。

2.3 标准品溶液的配制

取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥标准品各约10 mg，精密称定，以乙腈制成每1 mL中各含1 mg的溶液作为混合标准品储备液，再以乙腈稀释制成每1 mL中各含10 μg的溶液作为混合标准品使用液。取混合标准品使用液以含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸铵水溶液按一定比例稀释，得到各含0.5，1，2，5，10，25，50，100，200 ng/mL的标准系列工作液。

表2 质谱分析

2.4 供试品溶液的制备

取新鲜检材，以QuEChERS方式提取净化。

提取：精密量取全血（外周血）、尿液或唾液等不同样品各200 μL置5 mL离心管中，加入1 mL超纯水，涡旋30 s使分散均匀，加入150 mg无水硫酸镁与50 mg无水醋酸钠，涡旋30 s使分散，再加入2 mL含0.1 %甲酸的乙腈，涡旋3 min进行提取，然后在4℃以10000 r/min离心5 min，分取乙腈层，重复提取一次，合并2次的乙腈提取溶液置另一5 mL离心管中待净化。净化：加入50 mg无水硫酸钠，100 mg C18，50 mg PSA与50 mg GC，涡旋5 min使充分分散达到净化目的，其中C18可吸附磷酯类物质，PSA可吸附脂肪酸类物质，GC可吸附色素，然后在4℃以10 000 r/min离心5 min，分取乙腈溶液在45℃平行蒸发或氮吹至干，冷却至室温后精密加入200 μL含0.1 %甲酸的5 mmol/L甲酸铵水溶液复溶，超声30 s，以 5000 r/min离心，取上清液以0.22 μm微孔滤膜滤至小插管内，取续滤液测定。若检样中所测药物化学成分浓度过高，可适当以流动相初始溶液稀释至线性范围内，再行测定。

图1 标准溶液、加标样品及空白样品100 ng/mL时各离子对提取色谱图

加标样品制备：精密量取200 μL样品（全血），以10 μg/mL的混合标准品使用液为加标溶液，使加标样品终浓度为5，50，100 ng/mL，与上述提取、净化步骤一致进行制备。

2.5 巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥离子对提取色谱图，见图1。

2.6 定性确认

采用保留时间与对照品相一致，且提取的二级质谱图与标准品相一致，判为检出。见图2。

2.7 线性关系及检出限、定量限考察

取“2.3”项下的标准系列溶液按照“2.1”项下的色谱条件和“2.2”项下的质谱条件进样检测。以所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。结果见表3。

2.8 精密度试验

选用标准系列溶液中浓度为100 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表4。

图2 标准溶液与加标样品100 ng/mL时EPI二级质谱图比较

2.9 稳定性试验

选用标准系列溶液中浓度为100 ng/mL的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表5。

2.10 重复性试验

选用同一批次的全血样本，按“2.4”项下的方法制备6份平行样品，加标浓度为100 ng/mL，按本法检测巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥的含量。结果见表6。

表3 线性关系及检出限、定量限考察结果

表4 精密度试验结果

表6 重复性试验结果

表5 稳定性试验结果

2.11 回收率试验

以同一批次的全血样本，准确量取200 μL定量加入标准品，按“2.4”项的方法制备加标样品，进行检测，以3次平行结果的均值计算，高、中、低三个浓度的回收率均在88.0%～96.8%之间。见表7。

2.12 样品测定结果

选择了近2年9例患者样本（经本院伦理委员会批准），患者用药均为苯巴比妥，巴比妥类药物显效时间一般在0.5～1 h左右，选择给药后1 h采样进行检测，结果见表8。

表7 加标回收试验结果

表8 苯巴比妥监测结果

3 讨论

3.1 试品前处理

从相关文献[1-9]来看，还没有应用QuEChERS法用于巴比妥类药物检测的先例。本文采用了QuEChERS法处理生物样本（全血、尿液、唾液），从方法学验证结果来看能满足液质联用需要。本法简单、便利、快捷，实用性强。

3.2 质谱扫描模式

质谱扫描模式采用MRM-IDA-EPI，既有较高的灵敏度，检出限浓度达0.5 ng/mL，又能得到关联的二级质谱图，对所测组分进行确证，避免了假阳性结果，具有明显的优势。

3.3 方法设置

大多数情况下，内标法结果优于外标法，本处采用的是外标法，基于以下考量。从方法学证实的情况来看，此处外标法完全能够满足方法需要。从测试结果来分析，不同检材样品含量差异较大，高低相差几十倍，如果采用内标法，加入的内标量应与其含量相近，很难采用一致的浓度加入内标，需根据不同的样品来设置内标，在方法设置上有困难，可操作性差。内标物质的选择和使用也存在困难，氘代同种化合物很难得到，成本高昂，作为一般性监测，没有必要使用。从测试结果含量来看，其浓度在线性范围上限几倍至几十倍，可通过简单的稀释处理使样品测试液浓度降低，在达到线性范围要求的同时，有效地消除基质效应，使测定结果更可靠。