绿茶粉和绿茶多酚对犬的降脂作用

李 玉 徐怡钟 梁 婷 陶焕青 何 坤 郝 宁 邹苏萍 冯士彬 王希春 周裔彬 王一君 张劲松 吴金节 宛晓春*

(1.安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室，合肥230036；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036)

高血脂造成的肥胖及继发的心血管疾病不仅表现在人类生命体征上，也出现在日益受到大众喜爱的伴侣动物——宠物犬身上，严重危害着宠物犬的生活质量和身心健康，引起了兽医界的广泛重视[1]，这些健康问题不但困扰着宠物犬的主人，还直接影响着主人和宠物犬的生活质量。因此，寻找一个天然、健康的能够有效调节犬脂类代谢和能够替代药品长期食用的功能性犬粮显得尤为重要。众多研究表明，绿茶及其多酚不仅能控制动物体重，还能够降低动物血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量，降低心血管疾病的发生率。刘安军等[2]以绿茶为原料，应用不同的方法进行提取，利用提取物饲喂昆明小鼠后发现，各组小鼠体重均有所下降，平均下降了原始体重的10.1%，并发现脂肪沉积率降低。因此，如果将绿茶粉及绿茶多酚代替药物作为作为添加剂生产出具有降脂作用的功能性犬粮，不仅能够拓宽茶叶和茶多酚的使用空间，而且还可降低给宠物犬用药造成的身体伤害。

迄今为止，大多数研究者主要分析了茶叶当中某一单体或者某单一成分对啮齿动物、家禽等的功能性作用，而在犬类上的相关研究未见全面、系统的报道。李晶等[3]研究了绿茶粉对老年犬脂肪代谢以及抗氧化能力的影响，但该研究只是测定并分析了绿茶粉对于血清中各种生化指标的影响，并未对肝细胞脂肪代谢相关基因的表达量做出测定和分析。因此，本试验通过在饲粮中添加1.00%的绿茶粉和0.25%的绿茶多酚，分析绿茶粉及绿茶多酚对犬脂肪代谢和肝细胞脂肪代谢相关基因表达量的影响，探讨绿茶粉及绿茶多酚对犬的脂肪代谢是否具有调节作用，并进一步揭示其降血脂的作用机制，以期为绿茶粉和绿茶多酚作为添加剂应用于调节犬脂肪代谢的功能性犬粮的生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绿茶粉由安徽农业大学茶与食品科技学院馈赠，粉碎后过50目筛网，绿茶多酚购于芜湖天远科技有限公司，为浅黄色粉末，纯度为98.92%。绿茶粉和绿茶多酚的主要成分含量参见文献[4]。

1.2 试验设计

选取15只5月龄的体重相近、胎次一致、健康的本地田园犬，适应1周后，随机分为3组，分别为对照组、绿茶粉组和绿茶多酚组，每组5只(公母随机)。对照组饲喂基础饲粮，绿茶粉组饲喂在基础饲粮中添加1.00%绿茶粉的饲粮，绿茶多酚组饲喂在基础饲粮中添加0.25%绿茶多酚的饲粮。试验期为12周。试验期间按照常规免疫程序进行免疫。

1.3 基础饲粮

犬基础饲粮为上海淘乐思科技有限公司与美国淘乐思实验中心联合研制的恩途(Hentoo)全价犬粮。基础饲粮组成及营养水平参见文献[4]。

1.4 样品采集与处理

1.4.1 血液样品采集

分别于试验第0(试验开始前)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12周同一时间点臂头静脉采集4 mL血液(非抗凝)，3 000 r/min离心10 min，分离血清，分装在EP管中，-20 ℃保存待测。

1.4.2 肝脏样品的采集

试验结束当天，按照0.1 mL/kg BW的剂量肌肉注射鹿眠宁，等到麻醉较深后，颈静脉放血处死。打开犬的腹腔，剪断韧带和血管，剪掉肝脏上多余的脂肪，分离出肝脏，用生理盐水冲掉肝脏上的血液，立即切成1 cm3大小的组织块放入冻存管中，于液氮中保存，待测脂代谢相关基因mRNA相对表达量。

1.5 指标测定

1.5.1 犬血清脂代谢指标的测定

采用生化试剂盒，按照厂家(南京建成生物工程研究所)使用说明书测定犬血清中TG(终点法)、TC[磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶偶联(GPO-PAP)法]、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(固定时间法)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(固定时间法)的含量。

1.5.2 犬肝组织脂代谢相关基因mRNA相对表达量的测定

根据NCBI数据库中的目的片段序列，采用Primer 5设计引物，引物序列见表1。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定犬肝组织中乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)、脂肪酸合成酶(FAS)、载脂蛋白B-100(ApoB-100)、载脂蛋白A-1(ApoA-1)、脂肪酸转位酶(CD36)、过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)和酰基辅酶A氧化酶(ACO)mRNA相对表达量。

肝组织中总RNA的提取采用Trizol Reagent快速提取试剂盒(TaKaRa,日本)进行。将提取到的总RNA采用逆转录试剂盒(TaKaRa,日本)合成cDNA，反应结束后-20 ℃保存备用。使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa,日本)荧光染料，采用qRT-PCR法(ABI-7500PCR仪,美国)检测脂代谢相关基因mRNA的相对表达量。选用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，结果以2-ΔΔCt表示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 数据处理

应用SPSS 13.0软件进行数据统计，各组数据均用“平均值±标准误”表示，先进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，再采用Duncan氏法进行多重比较检验，P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和极显著。

2 结果与分析

2.1 绿茶粉和绿茶多酚对犬体重的影响

如表2所示，试验开始时3组犬初始体重相近(P>0.05)。在整个试验过程中各组犬体重整体呈增长趋势，试验前3周体重增长较快，且绿茶粉组和绿茶多酚组犬体重与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。从试验第4周开始，绿茶粉组和犬体重显著低于对照组(P<0.05)，这种差异性一直维持到第12周，绿茶多酚犬体重虽然也一直低于对照组，但仅在第6、11和12周出现显著差异(P<0.05)。试验进行到第12周时，对照组犬体重增长量比其他2组犬要高，对照组犬增长了162%，绿茶粉组犬增长了101%，绿茶多酚组犬增长132%，且茶多酚组和绿茶粉组犬体重显著低于对照组(P<0.05)，与对照组比分别降低了61%和30%。上述结果表明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能有效控制犬体重的增长。

2.2 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清TC含量的影响

如表3所示，与对照组相比，试验第0周时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清TC含量无显著变化(P>0.05)，各组维持在同一个比较相似的水平；试验第1～3周时，各组犬血清TC含量开始略有下降；从试验第4周开始，对照组犬血清TC含量虽有波动，但是体内血清TC含量基本维持在同一个水平，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清TC含量则开始下降。从试验第7周开始，绿茶粉组和绿茶多酚犬血清TC含量显著低于对照组(P<0.05)，这种变化趋势一直维持到第12周。试验进行到第12周时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清TC含量显著低于对照组(P<0.05)，相比对照组分别下降了21.7%、28.0%。上述结果表明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬血清TC含量。

2.3 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清TG含量的影响

如表4所示，在整个试验过程中对照组犬血清TG含量整体维持在0.9～1.1 mmol/L。试验前3周，各组血清TG含量基本不变，从试验第4周开始，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清TG含量开始缓慢下降，直至第8周2组同步表现出显著低于对照组(P<0.05)，并这种显著性差异一直维持到试验结束。试验第12周时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清TG含量均显著低于对照组(P<0.05)，相比对照组分别下降了21.0%、16.1%。上述结果表明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬血清TG含量。

表2 绿茶粉和绿茶多酚对犬体重的影响

与对照组比，同行数据肩标相同字母或不标字母者表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。表3至表6同。

Compared with the control group, values with the same or no letter superscripts in the same row mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significance difference (P<0.05). The same as Table 3 to Table 6.

表3 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清TC含量的影响

表4 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清TG含量的影响

2.4 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清LDL-C含量的影响

如表5所示，试验前4周，各组犬血清LDL-C含量变化不大，各组间差异不显著(P>0.05)；从试验第5周开始，绿茶粉及绿茶多酚组血清LDL-C含量开始下降，在试验第5、6周时与对照组相比差异不显著(P>0.05)，在第7～12周时均显著低于对照组(P<0.05)；试验进行到第12周时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清LDL-C含量均显著低于对照组(P<0.05)，相比对照组分别下降了28.1%、21.7%。上述结果表明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬血清LDL-C含量。

表5 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清LDL-C含量的影响

2.5 绿茶粉和绿茶多酚对犬血清HDL-C含量的影响

如表6所示，试验前4周，各组犬血清HDL-C含量维持在同一个水平，各组间没有显著差异(P>0.05)；从第5周开始，3组犬血清HDL-C含量均有所升高，且绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清HDL-C含量高于对照组，但差异不显著(P>0.05)；在试验第6～12周，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清HDL-C含量均显著高于对照组(P<0.05)；试验进行到第12周时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬血清HDL-C含量显著高于对照组(P<0.05)，相比对照组分别升高了18.5%、25.6%。上述结果说明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够升高犬血清HDL-C含量。

表6 绿茶粉和绿茶多酚对犬血液HDL-C含量的影响

2.6 绿茶粉和绿茶多酚对犬肝组织脂代谢相关基因表达的影响

如表7所示，与对照组犬相比，绿茶粉组和绿茶多酚组犬肝组织ACCαmRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05)，分别为对照组的24.8%和12.8%；肝组织FASmRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05)，分别为对照组的38.5%和23.5%；肝组织ApoB-100 mRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05)，分别为对照组的27.3%和31.1%；肝组织ApoA-1 mRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05)，分别为对照组的2.05、1.44倍；肝组织ACOmRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05)，相比对照组分别升高了34.2%和80.3%；肝组织PPARαmRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05)，分别为对照组的1.21和1.79倍。绿茶粉组犬肝组织CD36 mRNA的相对表达量高于对照组，为对照组的1.08倍，但差异不显著(P>0.05)，绿茶多酚组犬肝组织CD36 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，为对照组的1.73倍。上述结果说明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬肝组织ACCα、FAS、ApoB-100 mRNA的相对表达量，升高ApoA-1、ACO、PPARα和CD36 mRNA的相对表达量。

3 讨 论

研究表明，绿茶对体重有控制作用。Kuan等[5]通过30周的试验比较了普洱茶、乌龙茶、黑茶和绿茶对Sprague-Dawley鼠的作用，结果显示：在控制体重方面，乌龙茶优于普洱茶，普洱茶优于黑茶，黑茶优于绿茶；在降TG方面，乌龙茶和普洱茶优于绿茶和黑茶；但是在降TC方面，绿茶和普洱茶效果更好。这些研究结果表明，长期饲喂茶叶能控制鼠的体重并能降低血脂。本试验开始时3组犬的平均体重相似，没有显著差异，试验前3周犬体重快速增长，随着试验的进行，各组犬体重均在上升。试验结束时，绿茶粉组和绿茶多酚组犬平均体重分别比对照组降低了61%和30%。这说明，绿茶粉及绿茶多酚对犬均具有控制体重的作用。

表7 绿茶粉和茶多酚对犬肝组织脂代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

低密度脂蛋白(LDL)的主要作用是从血液中把机体内的TC转运到组织。当细胞需要TC时，细胞载脂蛋白B/E(ApoB/E)受体上调，促进TC进入细胞，以备机体利用。LDL所特有的载脂蛋白是ApoB-100，它是激活肝脏、肾上腺和脂肪组织细胞ApoB/E受体所需的关键性因子，肝脏和外围细胞的ApoB/E受体可以清除60%～80%的LDL-C。一旦细胞开始摄取LDL，TC开始被水解，用以合成细胞膜和激素，它们在合成细胞膜和激素中发挥重要的作用，过量的TC则被酰基辅酶A重新合成为胆固醇酯。另外，细胞内的胆固醇含量升高会抑制TC合成的限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(AHMG-CoA)还原酶的作用，同时细胞会减少ApoB/E受体的生成，阻碍细胞吸收更多的TC[6]。

高密度脂蛋白(HDL)在清除外周组织TC过程中发挥着重要的作用。HDL可以在肝脏和小肠新合成，它主要含有ApoA-1、载脂蛋白A-2(ApoA-2)、载脂蛋白C-1(ApoC-1)、载脂蛋白C-2(ApoC-2)、载脂蛋白C-3(ApoC-3)、载脂蛋白E(ApoE)。ApoA-1可激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，把HDL当中的游离TC和外围组织吸收的TC转化为胆固醇酯类，促进初生成的HDL向HDL3转变。额外酯化的胆固醇也可以转变为HDL2，它也可以从乳糜颗粒和极低密度脂蛋白(VLDL)的分解代谢中获得。在肝脂肪酶的作用下HDL2也可以向HDL3转变。利用胆固醇的可逆转变的过程，HDL把多余的TC从组织转移到肝脏，在肝脏吸收进入细胞合成细胞所需的物质[7]。

在调节体内脂代谢方面，绿茶粉和绿茶多酚均能降低犬血清中TC、TG和LDL-C的含量，均能升高犬血清中HDL-C的含量，但是绿茶粉和绿茶多酚的效果在不同方面效果不同。李晶等[3]研究发现，饲喂不同浓度绿茶粉的老年犬血清TG含量均有所下降，且犬血清TG含量与绿茶粉浓度呈正相关，当绿茶粉浓度为4 g/kg时，犬血清TG含量最高，与对照组相比下降了22.54%；饲喂不同浓度绿茶粉的老年犬血清TC含量均下降，添加1、2和4 g/kg绿茶粉的组与对照组比分别降低了15.21%、15.53%和26.38%；饲喂不同浓度绿茶粉的老年犬血清HDL含量均升高，试验结束时各绿茶粉添加组均与对照组存在差异显著；饲喂不同浓度绿茶粉的老年犬血清LDL含量均下降，试验结束时各绿茶粉添加组均与对照组存在差异显著。本试验中，试验进行到第12周时，与对照组相比，绿茶粉组和绿茶多酚组血清TG含量分别下降了21.0%和16.1%，血清TC含量分别下降了28.0%和21.7%，血清HDL-C含量分别升高了18.5%和25.6%，血清LDL-C含量分别下降了28.1%和21.7%。这说明在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬血清TG、TC和LDL-C含量，升高犬血清HDL-C含量，具有一定的降脂作用。

FAS是动物机体合成脂肪酸必不可少的物质，是动物新陈代谢的关键性因子。Yeh等[8]通过培养MCF-7乳腺癌细胞发现，茶多酚中的有效成分如儿茶素没食子酸(EGCG)和茶黄素(TF)均可抑制蛋白激酶B(Akt)的活化，并在一定程度上阻止刺激蛋白-1(SP-1)转录因子与FAS结构基因结合，抑制剂磷脂酰肌醇-3(PI3K)可以发挥同样的作用。由表皮生长因子(EGF)诱发合成TG、TC和脂肪酸同样也可被EGCG及TF3抑制。绿茶和绿茶多酚通过阻断表皮生长因子受体(EGFR)/PI3K/Akt/SP-1转导信号通路，从而抑制FAS的表达。Chiang等[9]研究发现，普洱茶能够抑制HepG2细胞中FAS的表达。从绿茶当中提取的52 μmol的EGCG就可使FAS的活性降低50%，猜测可能EGCG与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)有相同的结合位点，抑制了NADPH的活性，从而影响了细胞内脂肪酸的合成[10]。本研究表明，绿茶粉组和绿茶多酚组犬肝组织FASmRNA的相对表达量显著低于对照组，分别为对照组的38.5%和23.5%，说明绿茶粉和绿茶多酚能够抑制犬肝组织FAS的表达。

ACCα在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用，是脂肪酸合成的限速酶，它的主要功能是调节有关脂肪酸的合成。ACCα的活性在脂肪合成比较多的组织较高，一般情况下肝脏、脂肪和乳腺等组织中ACCα的活性高于其他组织。ACCα催化反应的终产物丙二酸单酰辅酶A在组织细胞中具有多种功能，它可以作为C2的供体为长链脂肪酸从头合成提供碳原子，碳链延长为长链脂肪酸后，可以利用组织的物质合成磷脂与TG[11]。Lin等[12]研究发现，茶叶及其茶多酚可促进腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)与LKB1的表达，进而抑制ACCα的表达。本试验中，绿茶粉组和绿茶多酚组犬肝组织ACCαmRNA相对表达量均较对照组显著降低，分别为对照组的24.8%和12.8%，说明在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%绿茶多酚能够降低犬肝组织ACCαmRNA相对表达量。

研究表明，机体脂肪代谢紊乱(代谢综合征)个体，使用茶叶提取物一段时间以后，个体血清TC、TG、LDL-C和ApoB含量降低，然而，于此同时血清HDL和ApoA-1含量呈现增加的趋势[13]。Goto等[14]研究发现，绿茶中的有效活性物质EGCG不仅能够上调低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达，同时还能下调细胞外载脂蛋白B(ApoB)的表达，从而促进机体内脂肪代谢。EGCG对LDLRmRNA相对表达量有明显的升高作用，并在一定程度上降低ApoB-100的含量[14]。LDL所特有的载脂蛋白是ApoB-100，它是VLDL转化为LDL的关键分子。本研究表明，绿茶粉和绿茶多酚可使犬肝组织ApoB-100 mRNA的相对表达量降低，绿茶粉组和绿茶多酚组分别为对照组的27.3%和31.1%；绿茶粉和绿茶多酚可使肝组织ApoA-1 mRNA的相对表达量显著升高，绿茶粉组和绿茶多酚组分别为对照组的2.05和1.44倍。这说明在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够降低犬肝组织ApoB-100 mRNA的相对表达量，升高犬肝组织ApoA-1 mRNA的相对表达量。

据报道，表没食子儿茶素(ECG)比其他儿茶素类优先在巨噬细胞中积累，因为ECG具有疏水性的化学结构特征。许多学者认为CD36是氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)的表达受体，经过比对发现，用抗CD36抗体处理后，巨噬细胞摄取OX-LDL的量能减少1/2[15-16]。在细胞上的研究发现ECG能够显著抑制CD36 mRNA的相对表达量。本研究结果发现，绿茶粉和绿茶多酚均能够增加犬肝组织CD36 mRNA的相对表达量，绿茶粉组和绿茶多酚组分别是对照组的1.73和1.08倍。这说明，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够升高犬肝组织CD36 mRNA的相对表达量。

ACO是相关细胞内和脂肪酸氧化有关的酶，有研究表明肥胖的动物体内该酶活性降低。ACO降低动物机体血清TG含量的功能是通过增加脂肪酸在过氧化物小体中的氧化能力来实现的。过氧化物酶体增殖活性受体(PPARs)为核激素受体超家族成员，其中PPARα主要通过上调过氧化物酶体中ACO和线粒体中肉碱脂酰转移酶 1(CPT1)的表达，来增加线粒体和组织细胞中过氧化物酶体代谢脂肪酸的能力。与对照相比，绿茶粉和绿茶多酚使犬肝组织ACOmRNA的相对表达量分别升高了34.2%和80.3%,说明在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够升高犬肝组织ACOmRNA的相对表达量。

PPARs是一种细胞内核受体，能参与细胞内多种代谢途径和细胞功能的调节。研究发现PPARs有3种不同的亚型[PPARα、过氧化物酶体增殖活性受体β(PPARβ)、过氧化物酶体增殖活性受体γ(PPARγ)]，它们之间有较高的序列同源性和结构相似性。由于组织分布的不同和靶基因分布的不同，它们有着不同的功能。其中，PPARα在脂类代谢、脂肪酸氧化等方面发挥着重要的生理功能。PPARα通过与维甲X受体结合形成异二聚体，再与靶基因PPARα的结合原件(PPRE)的结合来调节相关靶基因的转录[17]。罗居东等[18]研究表明，当用茶叶提取物EGCG处理癌细胞时，PPARα蛋白的表达量随着EGCG含量的增加而增加。PPARα受相关因子刺激后，通过相关的基因转录来调节过氧化物酶的表达、线粒体的β-氧化以及脂肪酸的吸收和TG降解，进而调控肝细胞内的脂代谢。当PPARα受体被相关因子激活时，通过调控细胞内相关脂蛋白代谢基因的转录，引起机体内脂代谢的变化。此外，PPARα还通过清除富含TG的乳糜微粒促进机体细胞内脂代谢的进行[19]。本试验结果表明，绿茶粉和绿茶多酚分别使犬肝组织PPARαmRNA的相对表达量升高到对照组的1.79和1.21倍，说明在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚均能够升高犬肝组织PPARαmRNA的相对表达量。

综上所述，在饲粮中添加1.00%的绿茶粉或0.25%的绿茶多酚能够有效降低犬血清TG、TC、LDL-C含量，升高犬血清HDL-C含量，抑制犬肝组织ACCα、FAS、ApoB-100的对表达，升高犬肝组织ACO、CD36、PPARα的表达，具有一定的降脂作用。通过绿茶粉与绿茶多酚的对比试验可知，绿茶多酚对犬的降脂效应在血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量中同步出现，在犬体重中滞后于绿茶粉，且随后又波动到无降脂效应，但最终出现降脂效应，此降脂效应与对照组形成显著性差异，说明在绿茶粉的降脂功效中，绿茶多酚起到关键性作用，绿茶多酚可为研究绿茶粉降脂机制提供参考物质基础。

4 结 论

本试验条件下，在饲粮中添加1.00%绿茶粉或0.25%绿茶多酚均能够有效控制犬的体重，调节犬体内的脂代谢，降低犬肝细胞ACCα、FAS、ApoB-100 mRNA的相对表达量，提高犬肝细胞ApoA-1、CD36、PPARα、ACOmRNA的相对表达量，从而发挥降脂作用。