γ-氨基丁酸对高温胁迫下高羊茅耐热性的调控

夏倩倩， 甘立军

(南京农业大学 生命科学学院， 南京 210095)

高羊茅(tall fescue)是一种常用冷季型草坪草，适宜生长温度为16℃～24℃，是常用的冷季型草坪草中年绿色期最长的一个草种，且因其质地柔软、色泽漂亮、外貌美观而得到众多人的喜爱。但高羊茅耐寒不耐热，超出生长最适温度时植株的生理代谢功能会发生一系列的变化，严重时会致死[1]。在我国南方，夏季高温是限制冷季型植物生长和发育的最普遍的非生物因子[2]。因此，解决高羊茅在我国南方难以越夏的困难问题迫在眉睫。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种含有4碳的非蛋白质氨基酸，水溶性较高，存在多种分子构象，广泛存在于原核和真核生物中[3]。GABA是生物自由氨基酸库的重要组成部分，参与生物体的多种代谢活动[4]。在动物中，GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质[5]。在植物中，GABA担任着代谢物质和信号物质的双重角色，参与了植物的 pH 调节、能源物质调节、C/N 平衡调节以及防御系统调节[6]。鉴于前人对GABA在植物逆境上的研究结果[7-8]，以及高羊茅的不耐热特性，本实验旨在探究GABA对高温逆境下高羊茅耐热性的影响及其调控机制，为GABA在冷季型草坪草越夏难题应用上开展初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

高羊茅品种为爱瑞3号，购于江苏省农科院。γ-氨基丁酸纯度为 98%，由Sigma公司提供。

1.2 试验处理方法和条件

称取等量(0.6 g)的高羊茅种子进行播种，自然条件(15℃～25℃)生长，定期浇水(2 d/次)，试验于南京农业大学牌楼实验基地进行。待植株长到两叶一心期(株高约10 cm)随机选择长势一致的健康植株进行试验处理。试验前期共设置7个预处理组，常温对照组(control组)、高温胁迫对照组(HS组)、高温胁迫GABA处理组(25、50、100、200和400 mg/L，分别记为HS+G25、HS+G50、HS+G100、HS+G200、HS+G400)。GABA预处理方法为叶面喷施法，喷施时使叶片上均匀附着细密雾珠且不聚集下滴，每盆喷液量为20 mL，每个处理8个重复，control组和HS组采用等量清水喷叶。喷施GABA 24 h后，于光照培养箱进行高温胁迫处理，高温42℃/30℃(昼/夜)水分供应充足。根据收集的实验数据类型，确定采样时间。在高温处理后第 0、3、6、12、24、48及第96小时分别取样测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的酶活性及H2O2含量。丙二醛(MDA)、可溶性糖和可溶性蛋白含量采于第8天。其他指标则在高温处理后第0、2、4、6和第8天分别取样测定。所有检测重复3次。

1.3 试验方法

1.3.1 重量测定

随机取每盆中30片大小一致的叶片，洗净去根后用吸水纸擦干，用万分之一天秤测量平均值，每个处理重复3次，即为鲜重。随后将其置于烘箱杀青10 min，之后80℃烘干至恒重后称量即为干重。计算植株相对含水量[10]，计算公式：植株相对含水量(%)=(30株初始鲜重-30株初始干重)/(30株吸水饱和鲜重-30株初始干重)×100%。

1.3.2 相对电导率的测定

参考Pawtowicz的方法[11]测定相对电导率：取植株叶片0.4 g用去离子水冲洗2次，用滤纸吸干，然后剪至1 cm左右小段，浸入15 mL去离子水中，真空渗入0.5 h使叶片完全浸入，然后于25℃放置3 h，用DJS-120型电导仪测电导率(S1)，再用沸水煮15 min，冷却到25℃时测总电导率(S2)。相对电导率(%)=(S1/S2)×100%。

1.3.3 丙二醛含量的测定

采用硫代巴比妥酸比色法[12]测定丙二醛含量。取试样叶片剪碎，混匀每份称取0.5 g，加入少量石英砂和5%的TCA试剂5 mL，研磨至匀浆，将匀浆于4000 r/min下离心10 min，其上清液为丙二醛提取液。取2 mL上清液，以蒸馏水作对照，各管加入0.67%硫代巴比妥酸溶液，在混合仪上混匀后密封，而后放入沸水浴中反应15 min后迅速冷却以终止反应并离心，取上清液在532 nm、600 nm和450 nm波长下测定吸光值，最后以干质量计算出丙二醛含量。

1.3.4 抗氧化物酶活性检测

称取叶片0.25 g，用蒸馏水清洗，擦干，剪碎后用0.05 mol/L PBS(pH 7.0，含1%的PVP)共5 mL冰浴研磨提取，在10 000 r/min下冷冻离心25 min，取上清液即为粗酶液，4℃冰箱保存备用。SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定[13]，以每单位时间内抑制光化还原50%的NBT为1个酶活性单位(U)；POD活性采用愈创木酚法[14]检测。APX酶活性的测定采用冯晴等[15]提供的方法进行，以OD290每分钟下降0.01 为一个酶活性单位(U)。

1.3.5 可溶性糖、可溶性蛋白的测定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[15]，样品提取液进行显色反应后在630 nm波长下比色。可溶性蛋白含量测定根据Bradford考马斯亮蓝G-250方法测定，样品提取液经考马斯亮蓝G-250蛋白试剂反应后，于595 nm波长下比色测定，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质的含量。

1.4 数据处理和分析

用GraphPad 5、Excel2003及PhotoShop等进行作图及数据分析，用Spass16.0进行差异显著性分析。多重比较采用Duncan′s法(P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 外源GABA对高温胁迫下高羊茅生长的影响

高温胁迫8 d各组高羊茅生长状况如图1所示。在高温条件下(42℃/30℃)，未经GABA处理的HS组高羊茅已经明显出现叶子发黄、干枯，甚至死亡的现象。而喷施不同浓度GABA的高羊茅则出现了对高温胁迫有不同程度的耐受现象。其中以100 mg/L的GABA处理效果最佳，其幼苗存活率较高、色泽较鲜艳、叶片挺直。

2.2 外源GABA对高温胁迫下高羊茅干鲜重和相对含水量的影响

高温胁迫下高羊茅干重、鲜重和相对含水量如图2所示。在高温(42℃/30℃)胁迫过程中，从第2天开始HS组幼苗株干重和鲜重随高温胁迫时间的增长而持续下降。而采用不同浓度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)预处理后，各GABA处理组高羊茅幼苗株相对于HS组其干重和鲜重下降幅度有所缓解。且从第2天后，HS+G100组高羊茅幼苗株干重和鲜重均显著高于其他GABA处理组(P<0.05)。高温胁迫至第8天时，HS组及不同浓度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)处理组干重较control组分别下降33.11%、29.99%、25.81%、20.45%、25.56%和24.87%，差异显著(P<0.05)，鲜重较control组分别下降了86.73%、57.04%、51.51%、28.72%、37.64%和35.13%，差异显著(P<0.05)。另外，高温胁迫0～6 d，与control组比较，各高温胁迫组之间的幼苗相对含水量有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)。但高温胁迫至第8天时，HS组幼苗的相对含水量较control组下降了32.50%，差异显著(P<0.05)。而HS+(G25、G50、G100、G200、G400)各处理组的相对含水量较control分别下降了8.12%、5.44%、2.84%、3.53%和3.52%，但无显著性差异(P>0.05)，其中100 mg/L的GABA处理组高羊茅幼苗株相对含水量相对于control组下降百分比最小。

图1 GABA对高温胁迫下高羊茅生长的影响

图2 GABA对高温胁迫下高羊茅干鲜重和相对含水量的影响

2.3 外源GABA对高温胁迫下高羊茅幼苗中丙二醛(MDA)含量的影响

高温胁迫条件下高羊茅幼苗中MDA含量如图3所示。高温胁迫至第 8 天，HS组高羊茅幼苗中MDA大量积累，其含量为(23.55±1.39)μmol/g，显著高于control组(6.97±0.47)μmol/g(P<0.05)。与此同时，经过不同浓度的GABA预处理的HS+(G25、G50、G100、G200、G400)各组幼苗中的MDA含量分别为

(16.85±1.26)μmol/g、(13.41±1.23)μmol/g、(7.02±0.75)μmol/g、(8.24±0.39)μmol/g和(8.51±0.26)μmol/g，其中HS+G100、HS+G200和HS+G400组与HS组比较MDA含量显著降低(P<0.05)。

与control比较，*：P<0.05；与HS比较，#:P<0.05

图3 GABA对高温胁迫下高羊茅叶片丙二醛含量的影响

Fig 3 Effects of GABA on MDA content in
tall fescue seedlings under heat stress

2.4 外源GABA对高温胁迫下高羊茅幼苗可溶性糖和可溶性蛋白的影响

由图 4-A可见，高温胁迫至第8天，常温条件下的control组幼苗体内可溶性糖含量为(8.25±0.90)mg/g，而高温胁迫条件下HS组幼苗体内可溶性糖含量为(18.21±1.06)mg/g，HS组可溶性糖含量显著高于control组(P<0.05)。经过不同浓度GABA预处理的HS+G(25、50、100、200、400)各组幼苗体内可溶性糖含量分别为(12.36±0.61)mg/g、(11.67±0.84)mg/g、(9.74±0.56)mg/g、(12.34±0.55)mg/g和(12.43±0.92)mg/g，与HS组比较呈现下降趋势，其中100 mg/L的GABA处理组幼苗体内可溶性糖含量与HS组比较差异显著(P<0.05)。如图4-B所示，高温胁迫条件下HS组幼苗体内可溶性蛋白含量为(7.39±0.54)mg/g显著低于control组(12.48±0.69)mg/g(P<0.05)。经过不同浓度GABA预处理后，HS+G(25、50、100、200、400)各组幼苗体内可溶性蛋白含量升高，但与HS组比较无显著性差异(P>0.05)。

与control比较，*：P<0.05；与HS比较，#:P<0.05

图4 GABA对高温胁迫下高羊茅可溶性糖(A)、
可溶性蛋白(B)含量的影响

Fig 4 Effects of GABA on soluble sugar (A) and soluble protein (B)
contents in tall fescue seedlings under heat stress

2.5 外源GABA对高温胁迫下高羊茅幼苗相对电导率的影响

高温胁迫下高羊茅幼苗相对电导率如图5所示。高温胁迫至第2天后，与control组比较，HS组幼苗叶片外渗液的相对电导率持续升高，差异显著(P<0.05)。采用100 mg/L的GABA预处理后，在高温胁迫下HS+G100组幼苗叶片外渗液的相对电导率较HS组增速放缓。高温胁迫至第8天，HS与HS+G100幼苗叶片外渗液的相对电导率相对于control组升高197.18%和154.62%，差异显著(P<0.05)。

图 5 GABA对高温胁迫下高羊茅叶片相对电导率的影响

2.6 外源GABA对高温胁迫下高羊茅幼苗H2O2含量及抗氧化酶活性的影响

高温胁迫下高羊茅幼苗H2O2含量如图6-A所示，高温胁迫可使高羊茅幼苗H2O2含量在短时间内急剧升高。高温胁迫至第3小时，HS组和HS+100组幼苗内H2O2含量分别为(4.11±0.29)μmol/g和(3.10±0.22)μmol/g，显著高于control组(0.98±0.07)μmol/g (P<0.05)。随后又迅速下降，6 h后始终保持较高水平。高温胁迫至第96小时，HS和HS+G100组的H2O2含量分别为control的2.16和1.69倍，且各时间点HS+G100组幼苗H2O2含量始终低于HS组。

高温胁迫下高羊茅幼苗内抗氧化酶SOD、POD和APX活性如图6-B、D所示。随着高温胁迫时间的延长，HS和HS+G100幼苗内抗氧化酶SOD、POD和APX活性出现先升高后降低的趋势，6 h达到峰值。高温胁迫至第6小时后，HS组和HS+G100幼苗内抗氧化酶SOD、POD和APX活性开始下降，且HS组下降幅度高于HS+G100组。

图6 GABA对高温胁迫下高羊茅H2O2含量及抗氧化酶活性的影响

3 讨论

高温是制约冷季型草生长和发育的最主要生态因素。目前，全球温室效应较为严重，许多冷季型草的生长都受到限制，即使环境中水分充足也常因细胞保水功能受限而脱水，产生一系列的代谢失衡[16]。当环境温度高于30℃时，容易引起草坪草生长缓慢，叶片萎蔫，叶色泛黄。本研究结果显示，在水分充足的条件下，高温(42℃/30℃)胁迫不仅可以导致高羊茅叶片泛黄和枯萎，还能造成高羊茅生物量(干重、鲜重和相对含水量)显著降低。而经过不同浓度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)预处理可以缓解高温对高羊茅的伤害以及抑制高羊茅生物量的降低，其中100 mg/L GABA预处理效果最佳。说明，GABA具有提高高羊茅耐热性的潜能。

MDA作为膜脂过氧化损伤的最终产物，其累积量会随外界伤害程度的加大而不断增大[17]。植物细胞的膜系统是高温胁迫下受害的主要部位，高温胁迫往往会导致冷季型草坪草产生严重的氧化胁迫现象，造成草坪草细胞膜严重受损，严重影响草坪质量[16]。本研究结果显示，高温胁迫至第8天，可导致高羊茅幼苗MDA含量显著累积，然而叶片喷施GABA可减少高羊茅幼苗体内MDA的积累。杨丽文等[18]研究也发现添加外源GABA可显著降低低氧胁迫下甜瓜幼苗叶片内MDA含量。说明，GABA可能是通过降低机体氧化损伤来提高高羊茅的耐热性。

大量研究表明[19-20]，逆境条件下机体会产生大量的氧自由基(例如H2O2)，进而引发膜脂过氧化作用而造成膜系统的伤害。同时，机体内也存在一套清除氧自由基的防御体系，而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)正是这一类防御体系中的重要成员。在本研究中，选择100 mg/L GABA预处理的高羊茅幼苗作为研究对象，检测了短时间高温胁迫下幼苗体内 H2O2及SOD、POD和APX的含量。结果显示，随着高温胁迫时间的延长，高羊茅幼苗体内H2O2含量均出现先升高后降低，再升高的现象，而SOD、POD和APX的含量则均出现先升高后降低的趋势，与文献报道一致[21]。其中100 mg/L GABA预处理可降低高羊茅幼苗体内H2O2含量以及提高抗氧化酶SOD、POD和APX的含量。高羊茅幼苗体内H2O2含量在第6小时突然降低，以及SOD、POD和APX的含量第6小时达到峰值，可能是由于高温胁迫导致机体防御体系被激活，随后由于高温胁迫持续，高羊茅幼苗体内不断产生氧自由基，导致氧化能力不断增强，抗氧化能力则不断减弱。

在高温逆境下，植物体内氧自由基不断积累，导致植物细胞膜遭受破坏，膜通透性增大，细胞内的电解质外渗，导致植物细胞浸提液的电导率增大[22]。本研究结果显示，持续高温胁迫可导致高羊茅幼苗叶片外渗液的相对电导率持续升高，这一结果与高温胁迫下高羊茅幼苗体内MDA含量和H2O2含量不断升高而相吻合。叶片喷洒100 mg/L GABA预处理降低高羊茅幼苗叶片外渗液的相对电导率，充分说明GABA预处理可以提高高温条件下高羊茅幼苗的耐热性。另外，GABA还可提高高温条件下高羊茅幼苗体内可溶性蛋白含量和降低可溶性糖含量。

综上，目前的研究表明GABA能改善高温胁迫下高羊茅草坪草的存活率、色泽等生长状况，并通过以上生理生化调节在总体水平上提高高羊茅草坪草的耐热性，100 mg/L是较佳的喷施浓度。然而，要确定GABA叶喷处理是否可以广泛的普及，还需进行进一步的探究和大田试验。