齐齐哈尔某规模化奶牛场腐蹄病病原分离鉴定和药敏试验

武晓东，冯万宇，周庆民，张 艳，侯美如

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

腐蹄病是奶牛最常见疾病，患病牛会出现跛行、运动困难、泌乳及繁殖性能下降等临床症状，严重者将予以淘汰，即使治愈后也会缩短使用周期，非常影响奶牛业的发展，给养殖者带来了很大的经济损失。本试验对齐齐哈尔某规模化奶牛场腐蹄病病料进行病原分离鉴定，通过病原菌药敏试验，为临床治疗提供了理论依据。

1 实验材料

1.1 病 料

齐齐哈尔周边某场奶牛病蹄组织，共计10头份。

1.2 主要试剂及药品

1.2.1 培养基制备常用试剂

蛋白胨、牛肉膏、磷酸氢二钠、七叶苷、氯化钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、硝酸盐相关试剂购自齐齐哈尔医药商厦。

1.2.2 药敏片

青霉素钠、头孢拉定、氨苄西林钠、舒巴坦钠、硫酸链霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、克林霉素、红霉素、万古霉素、甲硝唑等药敏纸片购自上海腾骞生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 LDZX-75KBS立式蒸汽灭菌器：上海申安；CKX31倒置显微镜：奥林巴斯（中国）；HYQX-I厌氧培养箱：上海跃进；AIN100恒温培养箱：重庆优迈。

2 实验方法

2.1 病料采集处理 在蹄部病变部位用灭菌注射器直接吸取深部脓汁排出气泡后，将针头插入无菌的橡皮塞内，运送至实验室。

将脓汁直接料涂于载玻片上，干燥固定后染色镜检。

2.2 病原分离培养

2.2.1 增菌培养 将病料接种于厌氧培养基，置于37℃恒温箱厌氧和有氧培养48h以上，染色镜检，观察细菌形态。将疑似病原菌的培养基放在－70℃冰箱保存备用。

表1 细菌生化试验结果

2.2.2 病原分离 取疑似病原接种肉汤进行厌氧增菌培养48h，然后取1mL注射试验兔颈部皮下，根据发病情况，隔3～5d再接种1次。采取死亡或发病兔肝脏坏死灶接种厌氧血琼脂培养基，放入厌氧罐37℃厌氧培养2～3d后，挑取单个菌落镜检观察。同时对死亡兔子进行剖检，观察病理变化；取病变组织涂于载玻片染色镜检观察细菌形态。

2.2.3 病原生化鉴定 将待检菌接种于有关生化反应管和培养基中，设相应对照组，37℃厌氧培养48h，观察生化结果，同时涂片镜检。

2.2.4 致病性试验 将试验哈白兔均为分为三组，每组6只，第一组在颈部皮下注射浓度为11.43×109/mL病原菌菌液1mL；第二组在颈部皮下别注射浓度为11.34×109/mL纯坏死梭杆菌标准株菌液1mL，第三组为对照组，皮下注射生理盐水1mL，注射后观察动物发病情况。

2.2.5 药敏试验 采用纸片法进行药敏试验，将普通肉汤纯培养菌液均匀涂布普通琼脂平板，贴上药敏纸片，37℃培养24h，观察结果。

3 结果

3.1 涂片镜检结果 对采集的病料直接涂片染色镜检，可见病料中有大量典型革兰氏阴性长丝状杆菌，该菌在厌氧血琼脂培养基上形成圆形、中央凸起、边缘不整齐、灰白色大小不一菌落，典型β溶血。在硫乙醇酸盐培养基中生长一致，能分解肉渣，有腐臭味。厌氧血琼脂培养基中培养48h后呈均一的细杆状。同时分离到其他杂菌。

3.2 生化试验结果 由表1可知，分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖并产气，但反应不剧烈，产生硫化氢和吲哚，使牛乳凝固并消化、有β溶血、脂酶降解阳性、不还原硝酸盐和水解七叶苷、液化明胶、有胆汁时候存在不生长，无运动性。根据生化试验结果，该菌与坏死梭杆菌生理生化特性基本一致。

3.3 动物实验结果 兔子接种3d后陆续发病后发病，接种部位出现脓包和红肿，内有大量浓汁，脓肿附近肌肉逐渐肿大，营养不良，精神沉郁，逐渐消瘦，15d后相续死亡。剖检可见肝脾明显肿大、表面有黄白色坏死灶。对照组实验动物无发病和死亡现象（表2）。

3.4 药敏试验结果 对分离出的坏死梭杆菌做临床常用药物药敏实验发现，该菌对头孢拉定、青霉素和氨苄西林高度敏感，对磺胺、庆大霉素、卡那霉素的严重耐药（表3）。

4 讨论

4.1 病原分离鉴定 对采集的病料直接涂片镜检，可见到有大量长丝状革兰阴性杆菌及其他杂菌，初步诊断为坏死梭杆菌。此外病料中还存在大量辅助菌和环境常在菌，考虑厌氧菌培养条件苛刻，试验以病料直接接种动物进行致病试验，在动物病变和健患交界处中直接分离病原菌并做生化试验，结果符合坏死梭杆菌生化特性。

表2 动物发病情况

4.2 动物实验 实验直接用分离株接种动物试验证明其致病性并在注射部位形成特征性坏死灶。耐过动物与死亡动物剖检后病理变化一致。

表3 药敏试验结果

4.3 药敏试验 结果证实该菌对先锋霉素、克林霉素、青霉素和氨苄西林钠高度敏感，对红霉素中度敏感，对卡那霉素、庆大霉素、链霉素和磺胺耐药。由于临床中头孢类及青霉素等对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和克雷伯氏杆菌治疗效果不明显。临床中对腐蹄病采取广谱药物治疗效果会更好。

5 结论

本试验对该奶牛场奶牛腐蹄病病料病原菌的分离培养，经病原鉴定证实：采集的奶牛腐蹄病病料中主要病原菌为坏死梭杆菌。药敏试验证实，该菌对临床中常用先锋霉素、克林霉素、青霉素和氨苄西林钠高度敏感，对红霉素中度敏感，对卡那霉素、庆大霉素、链霉素和磺胺耐药。