甜菜碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症及心肌细胞凋亡的影响

向家培 华晓芳 王 勇 刘长召 雷玉华

再灌注治疗是治疗心肌梗死最有效的方法，然而再灌注在挽救缺血心肌时，也会导致部分缺血心肌甚至正常心肌损伤，这种现象称为缺血再灌注(ischemia andreperfusion,IR)损伤。有研究[1]表明，阻断心肌血流，可以造成局部心肌70%的梗死，单纯给予再灌注治疗而不预防再灌注损伤可以将心梗面积从70%降到30%，而给予有效措施抑制再灌注损伤，可以将心梗面积从30%降低到5%，进一步挽救25%的心肌。因此如何预防和减轻心肌IR损伤，已经成为治疗心肌梗死的重要课题。甜菜碱作为一种食物来源的磷脂酰胆碱代谢产物，是肠道菌群影响心血管疾病发生发展的重要介质之一[2]。近年研究[3-4]发现，甜菜碱可以抑制大鼠心梗模型中，细胞间粘附因子和单核细胞趋化蛋白1等炎症因子的表达。而炎症是IR损伤的重要机制之一，抑制炎症可以抑制心肌凋亡，显著减轻IR损伤[5]。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein box 1，HMGB1)-白介素17A(interleukin-17A，IL-17A)-白介素6(interleukin-6，IL-6)炎症轴被证实在心肌IR损伤中发挥重要作用，可以通过诱导炎症瀑布样反应以及心肌细胞凋亡加重心肌IR损伤[6-7]。而甜菜碱是否可调节此炎症轴，以及甜菜碱对心肌IR中心肌细胞凋亡的影响尚无相关研究。因此，本研究拟通过大鼠IR模型，探讨甜菜碱对大鼠心肌IR的中炎症反应和心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选取18只SPF级成年雄性SD大鼠，均购于武汉大学动物中心，体质量200～250 g，于恒温、恒湿环境饲养48 h，大鼠可自由获取食物和水。

1.2 试剂和仪器 戊巴比妥钠(德国Merck Drugs & Biotechnology)；小动物人工呼吸机(安徽正华生物仪器设备有限公司)；离心机(TDZ5-W8台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶b(creatineKinase-MB，CK-Mb)和肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)( 南京建成生物工程研究所试剂盒)；高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，白介素17A(interleukin-17 A，IL-17A),白介素6(interleukin-6，IL-6)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(武汉华美生物工程有限公司Elisa试剂盒)；5×蛋白上样缓冲液( 中国阿斯本生物公司)； 12%SDS-PAGE分离胶[ 蒸馏水3.3 mL，30%丙烯酰胺(29∶1)4 mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL；10%SDS 0.1 mL；过硫酸铵0.1 mL，TEMED 5 μL]；5%浓缩胶[ 蒸馏水4 mL，30%丙烯酰胺(29∶1)1 mL，1M Tris-HCl(pH 6.8)1 mL；10%SDS 80 μL；过硫酸铵60μL，TEMED 8μL]；抗活化的caspase-3( 武汉三鹰生物技术有限公司 1∶100稀释)； Bcl-2( 美国santa公司，1∶500稀释)；Bax( 美国bioword公司，1∶800稀释)；辣根过氧化物酶标记的抗大鼠抗体( 中国阿斯本生物公司，1∶10 000稀释)。根据随机数字表将18只大鼠分为3组：假手术组(SO组)，缺血再灌注组(IR组)和甜菜碱组(西亚试剂)，每组各6只大鼠。

1.3 方法 SO组和IR组于造模前1 h给予生理盐水(10 mL/kg)灌胃， 甜菜碱组造模前1 h给予甜菜碱(450 mg/kg)溶于生理盐水(10 mL/kg)灌胃。2%戊巴比妥钠(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，气管插管(频率70 次/分，吸呼比1∶1.5，潮气量3～4 mL/100 g)，胸骨左缘剪开皮肤，分离肌肉，断第2和3肋，暴露心脏，SO组在左心耳下缘2～3 mm处将前降支下穿线不结扎，等待4.5 h后取颈静脉血和心尖部心肌组织。IR组和甜菜碱组将前降支与一中空带凹槽橡皮管结扎，30 min后剪断结扎线再灌注4 h。再灌注后，经颈静脉取血2 mL，迅速剪下心脏，取心梗和缺血区(心尖部变白的心肌)，生理盐水冲洗后冻于-80℃冰箱。比较3组大鼠心肌损伤标记物(LDH、CK-Mb、cTnI)，炎症因子(HMGB1、IL-17A、IL-6、TNF-α)和凋亡蛋白[活化的caspase-3，Bcl-2/Bax]的表达。

1.4 心肌损伤标记物的检测 采集颈静脉血2 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清，检测大鼠血清中心肌损伤标记物LDH、CK-Mb和cTnI。

1.5 炎症因子的检测 采用ELISA法检测大鼠心肌组织中炎症因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α表达。严格按照说明书操作。

1.6 凋亡蛋白的检测 组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2～3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃13 000 g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。Western Blot 法检测大鼠心肌组织凋亡蛋白活化的caspase-3，Bcl-2/Bax，评价心肌细胞凋亡水平。心肌组织匀浆后，取40 μg样本，加入适量5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min。配制12%分离胶，5%浓缩胶，浓缩胶80 V，分离胶120 V恒压电泳，300 mA恒流转膜，转膜时间60 min，与一抗孵育过夜，与HRP-goat二抗，室温孵育30 min后，ECL显色。

1.7 观察指标 检测并比较3组大鼠心肌损伤标记物(LDH,CK-Mb,cTnI),炎症因子和凋亡蛋白的水平。

2 结果

2.1 3组大鼠心梗标记物表达水平比较 IR组大鼠中心肌损伤标记物CK，LDH和cTnI表达水平高于SO组，差异有统计学意义(P< 0.05)。与IR组比较，甜菜碱组心肌损伤标志物CK，LDH和cTnI的表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 3组大鼠炎症因子表达水平比较 与SO组比较，IR组中心肌炎症因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较，甜菜碱组心肌炎症因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α的表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.3 3组大鼠心肌凋亡蛋白表达水平 与SO组比较，IR组中凋亡蛋白活化的caspase-3的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较，甜菜碱可以显著抑制心肌细胞凋亡，活化的caspase-3的表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表1 3组大鼠心肌损伤标记物表达水平比较

注：与SO比较,#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

表2 3组大鼠炎症因子表达水平比较

注：与SO组比较,#P<0.05；与IR组比较,*P<0.05

表3 3组大鼠凋亡蛋白表达水平比较

注：与SO组比较，#P<0.05；与IR组比较，*P<0.05

3 讨论

甜菜碱作为一种甲基化的衍生物可以从多种食物中获得，依靠肠道微生物代谢，在脊椎动物体内它不仅可以作为甲基供体，也参与维持机体渗透压和稳态。近年研究[5,8]发现，在异丙肾上腺素诱导心肌缺血的模型中，甜菜碱可以通过抑制心肌组织炎症因子单核细胞趋化蛋白1和细胞间黏附分子-1的表达，减轻心肌组织的炎症反应和心肌损伤。

前期研究[9]证实，HMGB1为一种早期促炎因子，不仅可以直接诱导心肌细胞凋亡，加重心肌IR损伤，也可以通过HMGB1-IL-17A-IL-6炎症轴反应，上调IL-17A，IL-6，TNF-α等炎症因子的表达，诱导炎症瀑布样反应，进而加剧心肌IR损伤。Hu等[10]的研究证实，心肌IR损伤的程度与HMGB1的表达水平呈剂量依赖型，HMGB1的表达水平越高，心肌IR损伤越重，通过BNP后处理等方式抑制HMGB1的表达可以显著抑制心肌IR损伤。可见HMGB1是心肌缺血再灌注损伤的关键炎症因子之一。有研究[8,11]证实，甜菜碱可以通过调控丝裂原活化蛋白激酶通路和信号转导与转录激活因子3调控下游IL-6，细胞间粘附因子等炎症因子的表达。Ma等[5]研究证实，在大鼠心肌IR模型中，丝裂原活化蛋白激酶通路参与调控HMGB1的释放。本研究发现，与IR组比较，甜菜碱组大鼠心肌组织中HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α的表达显著降低(P<0.05)。提示甜菜碱可以显著抑制大鼠心肌HMGB1以及下游炎症因子IL-17A、IL-6和TNF-α的表达。笔者推测甜菜碱抑制作用可能与丝裂原活化蛋白激酶通路有关。但信号转导与转录因子3通路以及是否有其他通路的参与甜菜碱对大鼠IR心肌损伤中炎症反应的调控过程尚需进一步实验证实。

心肌细胞凋亡调控机制可以分为细胞外途径和细胞内途径，且两种途径相互关联和影响。炎症因子可以激活细胞外凋亡途径。多种炎症因子与相应的受体结合，诱导含死亡片段的蛋白聚集，激活凋亡蛋白激酶caspase-8和caspase-3引起细胞凋亡[12]。内源性凋亡途径也称线粒体途径，氧化应激水平与此途径激活紧密相关，过量活性氧产生激活Bcl-2家族蛋白，增加促凋亡蛋白Bax的分泌和转移，通过与相应受体结合促进增加线粒体膜的通透性，诱导多种促凋亡蛋白，如细胞色素c，核酸内切酶G和Smac/Diablo释放，激活caspase-3和caspase-9，最终导致细胞凋亡[13-14]。本研究发现，与IR组比较，甜菜碱组活化的caspase-3表达水平显著下降，Bcl-2/Bax比值显著增加(P<0.05)。提示甜菜碱可以减轻大鼠心肌IR心肌细胞凋亡。此外甜菜碱为天然抗氧化剂，其是否可以通过抑制心肌IR中氧化应激水平抑制大鼠心肌细胞凋亡尚需进一步研究证实。

综上所述，笔者认为甜菜碱可以通过抑制炎症反应和心肌细胞凋亡，减轻大鼠心肌IR损伤。