高效液相色谱法同时测定糕点中6种合成着色剂

李明晖

摘 要：建立了一种同时测定糕点中胭脂红、苋菜红、日落黄、柠檬黄、亮蓝以及诱惑红的高效液相色谱法。本方法先用石油醚-乙醚混合液除去样品中的油脂，再用95%的乙醇溶液浸提，结合聚酰胺吸附法提取，制成水溶液，高效液相色谱法254nm、625nm两个波长同时测定6种合成着色剂。结果表明：采用该方法6种合成着色剂在浓度1.0～30.0μg/ml有良好的线性关系，相关系数均大于0.9999；方法检出限为柠檬黄0.5mg/kg、苋菜红0.5mg/kg、胭脂红0.5mg/kg、日落黄0.5mg/kg、亮蓝0.2mg/kg、诱惑红0.5mg/kg；回收率可达到81.0%～96.4%，相对标准偏差均不大于6.4%。

关键词：糕点；同时测定；合成着色剂；高效液相色谱法

中图分类号：TB 文献标识码：Adoi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2018.33.093

0 前言

中国有一句话说的是色、香、味俱全，是对这道菜最好的评价。糕点也不例外，“色”排在首位，作为糕点中最重要的感官指标之一，色泽直接影响到消费者的食欲。许多商家为了从感官上吸引客户的眼球，除了在加工工艺等方面改进产品的色泽外，还会通过添加人工合成着色剂来增加产品的色泽。较天然色素，人工合成色素颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低。因此，糕点生产企业存在超量超范围添加人工合成着色剂的情况，长期食用此类产品将严重危害人体健康。英国多动症儿童治疗中心的专家们指出，食用色素不仅影响儿童的生理和心理健康，使他们情绪失控，出现大哭大叫、失眠等状态，还会对某些过敏体质的成年人产生影响，使他们出现易怒等情绪不稳定的状况。

根据笔者近几年的工作经历，在糕点的日常监督检验和型式试验中涉及的人工合成着色剂多为胭脂红、苋菜红、日落黄、柠檬黄、亮蓝以及诱惑红，这6种合成着色剂现行的国标方法为GB 5009.35-2016和GB 5009.141-2016，其中GB 5009.35-2016方法定性定量准确但其适用范围并未包含糕点，而诱惑红的检验方法GB 5009.141-2016试验步骤繁琐复杂，本方法先用石油醚-乙醚混合液除去样品中的油脂，再用95%的乙醇溶液浸提，结合聚酰胺吸附法提取，制成水溶液，高效液相色谱法测定，建立了一种同时测定糕点中胭脂红、苋菜红、日落黄、柠檬黄、亮蓝以及诱惑红的高效液相色谱法，取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 试验样品

供试的10种糕点均为市售的普通糕点。

1.2 试验仪器与试剂

试验基本仪器为高效液相色谱仪1260（二极管阵列检测器，美国安捷伦公司）仪器条件为：色谱柱：Welch Ultimate XB C18（4.6×150 mm，5μm）；进样量：10μL；柱温：35℃；二极管阵列检测器波长：254 nm，625nm。梯度洗脱程序见表1。电子天平ME204E（0.0001g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），涡旋混合仪（江苏金坛市中大仪器厂），低速离心机（上海安亭）。

试验主要试剂为甲醇（色谱纯，CNW）、乙腈（色谱纯，CNW），聚酰胺粉、氨水（分析纯）、甲酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、石油醚（分析纯）、乙醚（分析纯）、柠檬酸（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、乙酸（分析纯）以上试剂均为国药集团化学试剂分析有限公司。胭脂红、苋菜红、日落黄、柠檬黄、亮蓝（墨质检坛，浓度0.5mg/mL），诱惑红（墨质检坛，浓度1.0mg/mL）。

1.3 试验方法

1.3.1 测定方法

称取5g左右已经粉碎均匀的样品于离心管中，加入50mL石油醚-乙醚（V∶V=1∶1）漩涡震荡后离心，弃去上清液，待有机试剂挥发干，再加入30mL 95%乙醇溶液，旋涡震荡，置于60～70℃恒温水浴超声仪中反复超声浸提，合并浸提液，加入柠檬酸溶液调节pH到6左右，加热至60℃，加入1g聚酰胺粉调成糊状搅拌均匀，以垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的温水洗涤数次，然后用甲醇-甲酸混合溶液（V∶V=6∶4）洗涤数次，再用水冲洗至中性，用无水乙醇-氨水-水混合溶液（V∶V∶V=7∶2∶1）解吸数次，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发近干，加水溶解，定容至5.00 ml，过0.45μm水相滤膜，待测。采用上述方法，对10种糕点中6种合成着色剂含量进行测定，每个样品平行测定 3 次。

1.3.2 方法验证

通过重复性试验和添加回收试验对测定方法的稳定性和准确性进行验证。（1）重复性验证 ：取有检出着色剂糕点样品5g，按照试验方法处理，平行样品5个，对各色素进行重复性实验，计算RSD。（2）添加回收试验： 取其中一個糕点样品5 g，平行测定6次，根据重复性试验中糕点各色素成分含量，选取5.0 mg/kg，10.0 mg/kg，30.0 mg/kg作为加标量，根据测定结果计算加标回收率。（3）检出限试验：称取5g的阴性糕点样品，按照建立的方法平行测定11次。

1.4 标准溶液曲线制作

吸取胭脂红、苋菜红、日落黄、柠檬黄、亮蓝标准溶液各1.00mL、诱惑红标准溶液0.50mL，用水定容于10mL容量瓶中，配置成50μg/mL的混合标准储备液。取50.0μg/ml的混合标准储备液，逐级稀释成1.00μg/ml，5.00μg/ml，10.0μg/ml，20.0μg/ml，30.0μg/ml五个浓度，按照上述色谱条件进样，以各色素峰面积对浓度做线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 前处理的优化

本方法根据糕点中含糖量、蛋白质、脂肪等较高，基质较复杂的特点，采用石油醚-乙醚混合溶液浸提除去脂肪，加入95%乙醇溶液加热超声浸提后，结合聚酰胺粉吸附法进行提取色素克服了水溶液-聚酰胺粉吸附法在操作过程中难抽滤、样品抱成团的问题，建立了一种糕点中着色剂测定的前处理方法。

2.2 流动相的优化

考察了甲醇、甲醇：乙腈（10∶1，5∶1，5；5，1∶5，1∶10）不同配比作为流动相有机相条件下6种着色剂的分离情况。结果发现采用甲醇：乙腈（v∶v=10∶1）为流动相有机相，克服了糕点基质、梯度洗脱带来的基线不稳，柱压增大等问题，基线更为平稳，而且各色素分离度、出峰时间合理。本方法采用甲醇：乙腈（v∶v=10∶1）作为流动相有机相。

2.3 检测波长的选择

利用检测器特有的可变波长的功能，考察了多个波长。综合考虑，结合实际工作需要选出在254nm条件下测定柠檬黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、日落黃，625nm测定亮蓝。254nm的条件下上述5种合成着色剂响应值都较为理想，但是亮蓝的响应过小（见图1，图2）。625nm的条件下亮蓝的响应最大，干扰较小。

2.4 该方法测定6种合成着色剂的线性关系及标准溶液谱图

由表2可知，采用该方法测定糕点中6种合成着色剂，其标准曲线的线性关系均良好， r值均大于0.9999；其中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红是254nm测定，亮蓝625nm测定。

由图1和图2（横坐标为时间min，纵坐标为响应值mAU）可知，采用该方法6种合成着色剂分离度、出峰时间、峰型、响应值都比较理想，满足试验要求。

2.5 该方法测定10中糕点中6种合成着色剂含量

采用建立的方法，测定了市售的10种糕点中6种合成着色剂的含量，结果其中两个品种糕点检出柠檬黄分别为0.021g/kg、0.052g/kg，一个品种糕点检出胭脂红0.053g/kg。糕点中柠檬黄和胭脂红两种着色剂在GB2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中指标为不得添加。这几种着色剂超标的糕点相较其他品种颜色均较为鲜艳。因此，建议广大消费者在购买糕点时慎重选择颜色艳丽的品种。

2.6 方法验证结果

2.6.1 重复性试验

重复性结果显示，RSD为4.9%，这说明试验重现性良好。

2.6.2 加标回收试验

由表3可知，加标回收率为81.0%～96.4%，相对标准偏差均不大于6.4%，表明该方法测定结果准确度较高。

2.6.3 检出限试验

采用3倍基线噪声水平作为检出限，则本方法的检出限为柠檬黄0.5mg/kg、苋菜红0.5mg/kg、胭脂红0.5mg/kg、日落黄0.5mg/kg、亮蓝0.2mg/kg、诱惑红0.5mg/kg，满足试验要求。

3 讨论与结论

本实验，利用检测器特有的可变波长的功能，多波长下测定，通过对前处理和流动相的优化，克服了糕点中着色剂测定中遇到的基质大，难处理等干扰，建立了一种同时测定糕点中6种合成着色剂的分析方法。结果表明，该方法的线性范围、回收率、检出限、精密度均可满足实际样品检测的要求。值得注意的是，本文研究未涉及糕点彩妆以及糕点中的馅料。此类糕点在运用该方法进行测定的时候，在样品前处理方面还需参照其他方法，以保证检测结果的准确性与可靠性。

参考文献

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