基于高分辨质谱的蛋白组学实验教学设计

万 建， 胡 原， 秦丽玮， 熊国梅， 李 兵， 万翠红, 杨继红

(华中师范大学 生命科学学院，湖北省生物学实验教学示范中心;国家级生物学虚拟仿真实验教学示范中心,武汉 430079)

0 引 言

蛋白质组学研究的对象是一个基因组所表达的全部蛋白[1]，是沟通基因组到最终生物表型的重要环节[2]，为科研工作者探究生命系统活动和内部复杂的分子调控机理提供了一个新的思路[3]。随着质谱技术的发展，蛋白组学的研究水平得到了飞速进步[4]。

近年来质谱质量分析技术快速发展[5]，从最初的三重四级杆到离子井、飞行时间再到现在的傅里叶变换[6]。质谱分析的精确度和分辨率取得了质的飞跃。Nano-LC-Q-Obitrap将纳升级液相色谱的高分离性能与高分辨的准确质量数Orbitrap检测技术相结合，具备优异性能和出色多功能性。为生命科学特别是蛋白组学领域提供了高质量的研究分析手段[7]。

为拓展学生专业视野，使学生了解目前生命科学的研究热点[8]。实验中心将液相色谱与质谱联用系统应用到研究生教学中。本文通过实验摸索建立了一套基于纳升级液相色谱与高分辨质谱(Obitrap)联用的实验方法，以人类全蛋白标样为材料，完成蛋白质的样品制备、液相色谱分离、质谱检测、蛋白质定量分析、生物信息分析的主要实验流程体系[9]。

1 材料与仪器

1.1 实验试剂

人类全蛋白酶解标准样品(Promega公司，美国)；色谱纯乙腈(Fisher公司，美国)；色谱纯水(Fisher公司，美国)；色谱纯甲酸(Fluka公司，瑞士)。

1.2 主要仪器及软件

纳升级液相色谱Easy-nLC1200(ThermoFisher公司，美国)；Obitrap质谱仪Q-Exactive Plus(ThermoFisher公司，美国)；小型涡旋仪MX-S(SCILOGEX公司，美国)；小型低速离心机D1008(SCILOGEX公司，美国)；蛋白分析鉴定软件Proteome Discoverer 2.1 SP1(ThermoFisher公司，美国)；蛋白数据库检索网站(http://www.uniprot.org/)。

2 实验方法

2.1 样品制备

将购置的人类全蛋白酶解多肽标准样品用纯水溶解，配成浓度为1 μg/μL的样品，在配好的样品中按照0.1%的体积比加入色谱纯级别的甲酸。涡旋混匀后离心备用。

2.2 色谱分离

色谱柱：预柱为Acclaim PepMap,C18,100 μm×2 cm,5 μm,10 nm(100 Å);分析柱为Acclaim PepMap,C18,50 μm×15 cm,2 μm,10 nm(100 Å)。

流动相：A相为含有0.1%甲酸的纯水；B相为含有10%纯水的乙腈，并加有0.1%的甲酸。流速为300 nL/min，洗脱梯度[10]见表1。色谱流出样品直接通过HESI离子源进入质谱。液相色谱进样量1 μL。

表1 色谱洗脱梯度

2.3 质谱检测

纳升级液相色谱分离后的多肽组分进入质谱进行检测分析。主要质谱参数：离子源电压2 kV；质谱采集模式为正离子模式；一级质谱采集分子量范围350～2 000 m/z;分辨率70 000；最大离子注入时间20 ms;二级质谱采集分辨率17 500；最大离子注入时间50 ms;TopN设定为20；碎裂能量设定为27 eV。

2.4 生物信息学分析

在开放的蛋白数据库网站Uniport(http://www.uniprot.org/)上查找人类全蛋白的氨基酸序列，并以FSATA格式进行下载[11]。导入到Proteome Discoverer 2.1 SP1软件中进行蛋白数据库检索。检索参数设定：比对多肽质量范围350 Da～5 000 Da;信噪比(S/N)>1.5;多肽片段中氨基酸个数范围6～144；母离子误差<10×10-6；多肽片段误差<0.2 Da;正反数据库比对检验阈值，显著0.05，极显著0.01。

3 结果分析与讨论

3.1 质谱检测结果分析

分析实验使用的人类全蛋白酶解多肽标样在质谱的总离子流(TIC)分布情况，总离子流分布均匀，并且质谱峰型分离明显可反映出液相色谱设置的合理与否，同时峰强度也可反映质谱检测的效率。纳升级液相色谱属于微量色谱，最小可在0.5 μL的上样条件下完成样品的高效分离。本次实验选用色谱分析柱填料为2 μm，在超过50 MPa(500 bar)的柱压下完成分析。实验采用数据依赖的质谱采集模式，完成一级质谱扫描后，依据一级质谱的结果，对质谱峰强度较高的母离子进行二级碎裂检测，得到二级质谱检测结果。依据此策略可获得样品中含量较高的离子二级质谱碎裂信息[12]。

3.2 质谱谱图分析

实验过程中进入质谱的样品为人类全蛋白酶解后的多肽片段，故质谱比对时也是以多肽片段为标准进行比对。例如，完成多肽序列比对后的结果(见图1)，比对上的多肽氨基酸序列为TAVCDIPPR。质谱中的高能碰撞池主要是对肽段主链的氨基进行裂解，一般而言，总是产生等量的b 和y 碎片离子。一个满意的序列分析一般需要对母离子进行主链裂解后的完全或接近完全的指认和归属[13]。此肽段由8个氨基酸组成，共比对上b碎片离子4个，y碎片离子8个(见图2)。

图1 多肽氨基酸序列碎片信息

依据此方法完成人类全蛋白的多肽序列比对，根据多肽片段的交叉覆盖度完成全蛋白序列的拼装。

3.3 蛋白质数据库检索

使用专业的蛋白质组学分析软件Proteome Discoverer 2.1 SP1完成蛋白质的鉴定[14]。依据button-up的策略，首先将大蛋白酶解为多肽片段，通过对多肽片段的鉴定，根据多肽片段的覆盖度完成蛋白氨基酸序列的组装，从而完成蛋白质的鉴定[15]。本次实验，首先筛选得到质量较好的质谱图42 625张，通过与Uniport数据库网站中的人类全蛋白多肽片段碎裂谱图比对，匹配上的质谱图22 592张，鉴定到肽段序列15 368条，这些肽段与数据库中的3 617个蛋白氨基酸序列匹配。对这些蛋白氨基酸序列去除重复最终鉴定到2 939个蛋白质。分析蛋白匹配的细节，可得到更多的信息。图3展示的是人类全蛋白中鉴定到的α-微管蛋白，蛋白氨基酸序列中有72.36%匹配到数据库中α-微管蛋白。实验采用button-up的策略的蛋白鉴定策略，酶解后的多肽拼装蛋白序列，由于样品肽段覆盖度及检索比对方法设置等原因比对结果很难达到100%。

图2 多肽氨基酸序列质谱图比对

图3 人类全蛋白氨基酸序列比对结果

3.4 生物信息学分析

具有相似序列的蛋白质具有相似的功能。因此，最可靠的确定蛋白质功能的方法是进行数据库的相似性搜索。并且许多功能可直接依据蛋白质序列预测出来。例如，疏水性信息可用于跨膜螺旋的预测[16]。通过Proteome Discoverer 2.1 SP1软件完成蛋白质功能数据库比对，得到检测蛋白在细胞中的定位以及蛋白功能预测。统计分析得到参与代谢过程的蛋白为鉴定到总蛋白数量的24.8%，参与细胞组成的蛋白14.7%、转运蛋白11.4%、生物调控蛋白19.78%、应激反应蛋白13.15%、其他未鉴定到功能的蛋白16.17%，见图4。

图4 蛋白质功能预测统计结果

生物信息学是目前生物学领域发展的热点之一，而蛋白组学后续的数据处理很大程度上依赖生物信息学的发展。通过将生物信息学分析融入到实验教学中，使学生们感受到生物信息学在数据分析中的强大功能。帮助他们在今后的学习和科研工作中更好地认识学科交叉的意义。

4 结 语

应用于教学的实验需要做到实验原理明确，实验步骤简单，实验结果稳定易得、再现性高[17]。本实验设计满足以上要求，且全部实验步骤耗时在2～3 h，但由于受到大型仪器设备使用的限制，使得本实验设计仅适合小班教学，故在研究生的实验教学中推行本实验教学设计。

实验过程中，学生可自主完成大型液相色谱与质谱联用仪器的样品检测，同时了解色谱洗脱梯度以及质谱检测模式的设定对实验结果的影响。了解高分辨质谱仪器的性能，扩宽学生对现代生物学分析仪器的认识。同时也让大型仪器在教学方面发挥作用，更好地服务于教学与科研。实验基于目前生物学研究的热点领域蛋白组学，融合了生物化学、分子生物学、生物信息学以及分析化学等领域的知识，使学生们体会到学科交叉对本学科的推动作用，增加学生对科研的兴趣。