鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料抗紫外线照射引起的皮肤光老化

,,, , ,

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

皮肤光老化属于皮肤的外源性老化,长期紫外线辐射将使皮肤中胶原含量减少,加速光老化进程,使得暴露部位皮肤粗糙、褶皱,出现红斑、色素沉着、表皮增厚等不可逆损伤[1]。皮肤光老化与多种皮肤病密切相关,如光化性角化病、皮肤癌等[2]。因此有效地预防和延缓皮肤光老化已成为人们迫切关注的问题。

研究表明,胶原蛋白活性肽可以有效改善紫外线照射对皮肤的损伤[3-5]。Chen等[6]发现,鳕鱼皮胶原蛋白肽通过激活光老化皮肤中的TGF-β/Smad信号通路促进基质胶原的合成,抑制MAPK/AP-1和NF-κB信号通路的激活来抑制胶原的降解,从而缓解紫外线照射引起的皮肤光老化。Pullar等[7]表明,维生素C刺激胶原蛋白合成并协助防止紫外线引起的光损伤。因此,以鳕鱼皮胶原蛋白肽和维生素C为主要活性成分开发天然安全、风味口感好,且具有美容保健功效的饮料,具有重要意义。然而,胶原蛋白饮料绝大多数都是由化妆品工业生产,围绕胶原蛋白肽饮料产品的研究很少,针对其具体作用效果和作用途径的研究少见报道[8]。

本文中的鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料(CJD)是以鳕鱼皮胶原蛋白肽、水果浓缩汁为主要原料,按照一定的比例复配,制备出橙黄明亮,果香浓郁,酸甜适中,口感爽滑的液体饮料。本实验通过构建UVA-UVB复合紫外光源诱导的小鼠皮肤光老化模型,灌胃液体饮料,来研究该饮料对紫外线诱导的皮肤光老化模型的皮肤组织和胶原合成等的具体影响,确证其是否具有抗皮肤光老化作用,为从分子生物学角度探讨胶原蛋白肽饮料预防和延缓皮肤光老化的机制奠定理论基础,为相关产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳕鱼皮胶原蛋白肽 纯度为84.3%,山东东方海洋科技股份有限公司;苹果浓缩汁、柠檬浓缩汁 山东安德利集团有限公司;维生素C 河南祥盛食品添加剂有限公司;三氯蔗糖、麦芽糖醇、柠檬酸和柠檬酸钠 食品级市售;SPF级ICR小鼠 雄性,4～6周龄,18～22 g,北京动物研究所;超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测定测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定测试盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂 均为国产分析纯。

MLS-3750高温高压灭菌锅 日本Sanyo株式会社;实验型超高温UHT杀菌机 上海达程实验设备有限公司;紫外光源 UVA紫外灯管,40 W,峰值为340 nm,2只;UVB紫外灯管,40 W,峰值为313 nm,1只 南京华强电子有限公司;UVA型、UVB型紫外单通道强度测试仪 北京师范大学光电仪器厂;OLYMPUS DP70型显微成像系统 日本OLYMPUS公司;Leica RM2235组织切片机 德国Leica公司;T18型超细组织匀浆机 德国艾卡仪器设备有限公司;BioTek Synergy酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料的制备 鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料由中国海洋大学食品学院自行研制,主要工艺流程为:将棕色灌装瓶在高温高压灭菌锅内灭菌(121 ℃,20 min)后,放置紫外下备用;称取胶原蛋白肽1 kg、苹果浓缩汁0.8 kg、柠檬浓缩汁0.07 kg、维生素C 6 g,加纯净水完全溶解;配方优选,添加一定比例麦芽糖醇等甜味剂和柠檬酸等酸味剂对其进行调配,加纯净水定至10 L;采用超高温瞬时杀菌(125 ℃,5 s),而后进行无菌灌装。

1.2.2 鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料的测定 多肽含量的测定：采用双缩脲比色法进行测定[9]。还原糖含量的测定:按照GB 5009.7-2016《食品中还原糖的测定》中第一法 直接滴定法进行检测。还原型VC含量的测定：按照GB 5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》中第三法 2,6-二氯靛酚法进行检测。微生物检测：按照GB 4789.2-2010进行产品菌落总数测定；按照GB 4789.15-2016 进行产品霉菌和酵母计数；按照GB 4789.3-2010进行产品大肠菌群计数。

1.2.3 皮肤光老化小鼠模型建立 选取健康的ICR雄性小鼠60只,随机分为5组:正常对照组(NC)、模型组(MC)、胶原蛋白肽饮料低剂量组(CJD-L)、中剂量组(CJD-M),高剂量组(CJD-H)。CJD-L、CJD-M、CJD-H分别灌胃3.75、7.5、18.75 mL/kg·d(相当于人推荐摄入量的4.5、9、22.5倍)的胶原蛋白肽饮料,NC和MC组灌胃等量的蒸馏水。实验期间,各组小鼠自由进食和进水。在紫外照射实验开始前,各组小鼠预防性灌胃2周,第3周开始脱毛并照射紫外线,照射前30 min灌胃,直至实验结束。其中NC组只灌胃不进行紫外照射。给药辐照累计达4周后,UVA和UVB累积照射剂量分别是7.62和0.94 J/cm2。

1.2.4 小鼠脏器指数的测定 最后一次紫外线照射结束,小鼠禁食12 h,称重后摘眼球取血处死小鼠。取出肝脏、肾脏、脾脏和胸腺后用滤纸擦干并立即称重。根据以下公式计算脏器指数:

肝脏指数(mg/g)=肝脏重量(mg)/体重(g)

肾脏指数(mg/g)=肾脏重量(mg)/体重(g)

脾脏指数(mg/g)=脾脏重量(mg)/体重(g)

胸腺指数(mg/g)=胸腺重量(mg)/体重(g)

1.2.5 小鼠皮肤组织形态学观测 每日给药辐照后20 min,观察并拍照记录活体小鼠裸露皮肤的表观状态。

1.2.6 小鼠皮肤组织HE染色 取小鼠造模裸露处同一部位皮肤置于4%的甲醛溶液中,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,将蜡块连续切为4 μm薄片,脱蜡,常规复水,HE染色。通过显微镜观察各组小鼠皮肤组织的结构特征。

1.2.7 小鼠皮肤中水分含量的测定 取小鼠造模裸露处同一区域的皮肤,剪碎后均匀放置于称量瓶内,按照GB/5009.3-2016中直接干燥法进行测定[9]。

1.2.8 小鼠皮肤中羟脯氨酸(HYP)含量的测定 采用氯胺T法测定皮肤中羟脯氨酸含量[10]。

1.2.9 皮肤组织中T-SOD、CAT、GSH-Px、MDA的测定 取同一区域的小鼠造模裸露处皮肤,用生理盐水根据组织的质量比制成10%组织匀浆液,离心(3500 r/min,10 min)后吸收中间层的清液备用,全程保证低温。根据试剂盒说明书测定皮肤组织匀浆中T-SOD、CAT、GSH-Px的活力,MDA和总蛋白含量。

1.2.10 血清中T-SOD、CAT、GSH-Px、MDA的测定 造模结束后,小鼠摘眼球取血,血液置于37 ℃水浴中放置1 h,室温下以3500 r/min离心10 min,取血清于4 ℃冷藏备用。根据试剂盒说明书测定血清中T-SOD、CAT、GSH-Px的活力以及MDA含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对各组数据进行单因素方差分析,数据以平均值±标准偏差表示,同时用 LSD 法进行两两比较,p<0.05表明组间具有统计学显著性;p<0.01,表示各组间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 CJD中营养成分的含量

经过测定，杀菌后每瓶(100 mL)CJD含功效成分：胶原蛋白肽7.8 g，维生素C 54.67 mg。通过卫生学指标检验，该饮料符合国家标准，为安全产品。

2.2 CJD对光老化小鼠脏器指数的影响

在动物模型试验中,肝脏和肾脏指数常用来评价受试物对小鼠的毒副作用[11]。与正常组相比,CJD各剂量组小鼠的肝脏指数和肾脏指数无显著性差异(p>0.05),说明CJD对小鼠无毒副作用。脾脏在体液免疫和细胞免疫中发挥着重要作用[12]。胸腺是T淋巴细胞发育和成熟的地方,胸腺的萎缩会导致机体的细胞免疫功能降低[13]。因此,脾脏和胸腺指数的变化在一定程度上能反映机体免疫功能的变化。图1B,MC组小鼠脾脏指数和胸腺指数显著降低(p<0.01,p<0.05)。与MC组相比,CJD可以呈剂量依赖性提高脾脏指数和胸腺指数,其中CJD中、高剂量组显著提高脾脏指数(p<0.05),CJD高剂量组显著提高胸腺指数(p<0.05)。结果表明,CJD能有效防止免疫器官的萎缩,从而提高光老化皮肤小鼠的免疫功能。

图1 CJD对光老化小鼠脏器指数的影响Fig.1 Effect of CJD on visceral indices注:与正常组相比,##p<0.01,#p<0.05;与模型组相比,**p<0.01,*p<0.05;图4～图7同。

2.3 CJD对光老化小鼠皮肤外观的影响

通过小鼠皮肤的表观特征,可判断出紫外线照射下各组小鼠皮肤的损伤状况。如图2所示,正常组小鼠皮肤红润、光滑,表皮紧贴表面,无皱纹,充满弹性;而模型组小鼠皮肤红斑严重,干燥粗糙、多褶皱,皮肤增厚变硬,无光泽且脱屑,表明辐照造模成功。实验组小鼠的皮肤外观较模型组明显改善,裸露部分仅有稍许皮肤增厚,且紫外损伤程度随给药剂量增加而明显减轻。CJD低剂量组小鼠皮肤红斑较重,表皮粗糙,仍有部分褶皱。CJD中剂量组小鼠皮肤红斑较少,褶皱消失,粗糙干燥现象修复明显,但肤色暗沉无光泽。CJD高剂量组小鼠皮肤接近于正常组,光滑水润,富有弹性,略有脱屑。结果表明,CJD对紫外线引起的皮肤光老化具有显著的防护作用。Fujii等[14]研究发现,富含维生素C的阿米拉提取物和胶原蛋白肽能够协同抑制皮肤皱纹的形成和水分的流失,这可能是CJD能够显著预防和延缓皮肤光老化的原因。

图2 CJD对紫外线照射小鼠皮肤外观的影响 Fig.2 Effect of CJD on the clinical signs of UV-irradiation mice skin

2.4 CJD对光老化小鼠皮肤组织形态的影响

由图3各组小鼠皮肤组织的HE染色结果可以看出,NC组小鼠皮肤中各层结构完整,表皮与真皮连接处紧密。表皮组织细胞排列整齐,分层清晰,表皮层较薄;真皮层中,波浪状胶原纤维束排列有序且分布均匀,疏密有致,间质散在分布均匀的纤维母细胞。MC组小鼠的皮肤结构紊乱,分层模糊,表皮层不甚完整,呈现不规则增厚,表皮与真皮分界不清;真皮层组织排列紊乱,胶原纤维断裂,数量大幅减少,且成团严重,分布稀疏,有较多的炎性细胞浸润,这与Hou[5]等研究的紫外线引起的光老化小鼠皮肤的变化特征一致。与MC组相比,CJD各实验组小鼠的皮肤组织受损程度得到缓解,表皮组织结构比较完整,厚度不一;真皮层纤维排列趋向整齐,结团现象消失,排列有序,纤维断裂和破碎减少,说明CJD能有效改善光老化小鼠皮肤组织和胶原纤维的受损情况。其中CJD中、高剂量组改善效果最明显,接近正常组织。

图3 CJD对皮肤组织形态的影响(200×)Fig.3 Effect of CJD on histological morphology(200×)

2.5 CJD对光老化小鼠皮肤中水分含量的影响

水分对于维持皮肤的饱满、弹性、光泽起到重要作用。皮肤中水分含量下降,易出现干燥皱纹、粗糙等现象。试验结果显示(图4),模型组小鼠皮肤中水分含量与正常对照组相比下降了24.27%,呈现显著性差异(p<0.01)。与MC组相比,CJD中、高剂量组显著提高了皮肤中水分的含量(p<0.05,p<0.01),表明CJD可以有效抑制光老化小鼠皮肤中水分含量的降低。

图4 CJD对皮肤组织中水分含量的影响Fig.4 Effect of CJD on water content in the skin

2.6 CJD对光老化小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的影响

羟脯氨酸是皮肤胶原蛋白中含量丰富且稳定的氨基酸,因此可通过定量测定皮肤中羟脯氨酸含量来反映真皮内胶原的含量,从而评价皮肤衰老的程度[14]。结果显示,模型组小鼠皮肤中羟脯氨酸含量与正常对照组相比下降了51.86%,呈现显著性差异(p<0.01)。这表明紫外线照射显著降低小鼠皮肤中胶原的含量,皮肤趋于老化。CJD各实验组小鼠皮肤中HYP的含量极显著高于模型组(p<0.01),低、中、高剂量组Hyp含量分别提高到NC组的76.99%、88.64%和96.06%,剂效关系明显,其中CJD高剂量组与NC组小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量相当。本实验结果表明CJD能有效地维持胶原的含量,从而有效地抑制紫外线诱导的皮肤老化,这与组织形态学染色的结果一致。研究表明,胶原蛋白肽经口服后,会在皮肤处特异性富集并被利用,胶原蛋白肽通过激活TGF-β/Smad信号通路促进皮肤基质胶原的合成,通过抑制胶原降解过程中关键酶的表达来抑制胶原的降解代谢[15-16]。目前已有大量研究表明胶原蛋白肽和维生素C能够协同上调I型胶原mRNA的表达水平[17]。

图5 CJD对皮肤中羟脯氨酸含量的影响Fig.5 Effect of CJD on HYP level in the skin

2.7 CJD对光老化小鼠皮肤抗氧化能力的影响

为了进一步探索CJD抗皮肤光老化活性的初步机理,对各组小鼠皮肤组织及血清中的内源性抗氧化物酶的活力和过氧化物的含量进行测定。由图6可知,MC组小鼠皮肤中T-SOD、CAT和GSH-Px平均活力与NC组相比极显著下降(p<0.01),分别下降了41.57%、56.77% 和40.90%。这说明紫外线照射会导致皮肤产生较多的自由基,破坏氧化应激反应的动态平衡,导致氧化损伤,从而引起皮肤的光老化。与MC组相比,不同剂量的CJD均能提高抗氧化酶的活力,且具有剂量依赖关系。其中CJD中、高剂量组均能显著提高T-SOD的活力(p<0.05,p<0.01);CJD各实验组均能显著提高CAT的活力(p<0.05);CJD中、高剂量组均能极显著提高GSH-Px的活力(p<0.01)。结果表明,CJD中、高剂量组与NC小鼠组织中的抗氧化酶的活力相近。MDA是脂质过氧化反应的最终产物,其含量是衡量脂质过氧化和机体组织受氧化损伤程度的重要指标。紫外线辐照会导致皮肤中MDA含量提高,其中MC组小鼠皮肤中MDA含量较NC组极显著提高(p<0.01);而同时服用CJD可以显著抑制紫外线诱导的MDA含量的上升(p<0.05)。与MC组相比,CJD中、高剂量组的MDA含量分别降低了41.58%和44.88%。表明CJD具有显著促进光老化小鼠抗氧化功能的作用,有效防止机体过氧化。

图6 CJD对光老化小鼠皮肤抗氧化能力的影响Fig.6 Effect of CJD on antioxidant ability of photoaging skin

2.8 CJD对光老化小鼠血清抗氧化能力的影响

由图7可知,MC组小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-Px活力与NC组相比显著下降(p<0.05)。与MC组相比,不同剂量的CJD均能提高抗氧化酶的活力,且剂效关系明显。其中CJD中、高剂量组均能显著提高血清中T-SOD、GSH-Px和CAT的活力(p<0.05),与NC小鼠活力相近。MC组小鼠血清中MDA含量较NC组显著性提高(p<0.01),表明紫外线辐照会导致小鼠血清中MDA含量提高;而CJD中、高剂量组小鼠血清中MDA含量较MC组显著降低(p<0.05),分别降低了26.28%和29.08%。表明CJD能够提高血清中抗氧化酶的活力,避免机体内过氧化,降低光老化模型小鼠血清中MDA的含量。

图7 CJD对光老化小鼠血清抗氧化能力的影响Fig.7 Effect of CJD on antioxidant ability of serum

3 结论

鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料能有效地改善紫外线照射导致的小鼠皮肤光老化,且作用效果呈剂量依赖型关系。该复合饮料显著提高了光老化小鼠的脾脏指数和胸腺指数(p<0.05),有效地防止免疫器官的萎缩,提高免疫功能;能提高小鼠皮肤和血清中T-SOD、GSH-Px、CAT的活性,降低MDA含量,有效防止机体内过氧化;能有效维持光老化小鼠皮肤中胶原及水分的含量。因此,鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料能有效改善光老化小鼠皮肤组织的损伤程度,为从分子生物学角度确证胶原蛋白肽饮料预防和延缓皮肤光老化的作用奠定了理论基础。