MiR-199b-5p过表达在肾小球足细胞中的作用及基因表达特征

龚向前，鱼敏逸，陈俊宇，顾欣雨，李善文，张爱青，甘卫华

(南京医科大学第二附属医院 儿科，江苏 南京 210003)

足细胞是一种高度分化的上皮细胞，在保持肾小球滤过屏障的完整性中起重要作用，防止蛋白尿的发生。足细胞易受到各种损伤，且增殖能力较差，损伤后很难再生[1]，足细胞损伤后导致肾小球滤过屏障减弱，引起蛋白尿的发生[2]。蛋白尿是导致肾功能损伤的危险因素，因足细胞损伤引起的肾脏方面疾病是全球性问题。microRNAs是一大类小型非编码RNA，可以诱导靶基因的转录后沉默，调控众多的生物学过程，在细胞发育及凋亡中均发挥重要作用[3]。研究发现，microRNAs(miRNAs)是维持足细胞体内平衡所必需的，在肾脏的病理和生理过程中有重要的调控作用，miRNAs的缺失会引起足细胞损伤，导致蛋白尿的产生[4]。前期研究中发现miR-199b-5p在正常小鼠和阿霉素肾病小鼠中差异表达，miR-199b-5p保守性相对较高，在多个物种中都有表达(表1)。本研究通过高通量测序了解足细胞过表达miR-199b-5p后基因表达变化及在足细胞凋亡中的作用，旨在为临床治疗肾脏疾病提供新的理论依据及治疗手段。

表1 不同物种miR-199b-5p成熟序列

序列号物种碱基序列MIMAT0000263hsa-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguucMIMAT0000672mmu-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaccuguucMIMAT0013780eca-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguucMIMAT0017339 ssc-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguu

1 材料与方法

1.1 实验材料 正常小鼠足细胞(Mundel教授惠赠:Albert Einstein college of Medicine)；胰蛋白酶、1640培养液(美国Gibco公司)；干扰素-γ(英国pepro Tech公司)；lipofectamine 2000、miR-199b-5p mimics、miRNA NC(上海吉玛公司)；qRT-PCR 试剂盒(锐博公司)；凋亡试剂盒(BD公司)；Trizol试剂盒(美国invitrogen公司)；PCR仪、FACSVerse流式细胞仪(法国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 永生化小鼠足细胞在添加10%胎牛血清、10 μL/mL青霉素和100 μg/mL链霉素、10 U/ mL重组小鼠干扰素-γ的RPMI 1640培养基中，含有5%CO2的加湿培养箱中33℃促进生殖传代，在细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰酶消化传代。传代2次后在37℃不含干扰素-γ培养基中诱导细胞分化成熟，待培育12d 分化成熟后用于实验。

1.2.2 细胞转染 小鼠足细胞按每104/孔左右接种在6孔板中，当细胞生长至70%～80%融合时弃去培养液进行瞬时转染。将6孔板分为空载对照(NC)组和过表达质粒组(mimics组)，每孔使用200 μL无血清培养基分别稀释5.0 μL miRNA NC、miR-199b-5p mimics，同时取6 μL lipofectamine 2000稀释到200 μL无血清培养基中，两者在5 min内混匀，室温放置20 min后加入不含血清的2 mL培养液中，6 h后更换成新鲜无血清培养基，培养48 h诱导足细胞损伤。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR 细胞转染48 h后，按Trizol试剂盒说明书操作，每孔加0.5 mL Trizol提取NC组和mimics组细胞的总RNA。使用紫外分光光度计测定A260/A280处RNA吸收峰，并对总RNA进行定量。按照qRT-PCR试剂盒，反应总体系为10 μL，将得到的RNA逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR选用20 μL反应体系，每个体系含10 μL SYBR Green，2 μL模板cDNA，上下游引物各0.8 μL；反应条件如下：预变性(95℃，10 min)、变性(95℃，10 s)、退火(60℃，20 s)、延伸(70℃，10 s)40个循环。以内源性U6作为对照基因使数据标准化，每组重复3次，按照2-(ΔΔCt)法，计算目的基因相对表达量。

1.2.4 流式Annexin V-PE/7-AAD检测足细胞凋亡 足细胞在无血清培养液中培养48 h诱导足细胞损伤，每组重复3次，用不含EDTA 胰酶消化后收集足细胞，用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞并离心，加入Bling Buffer重悬足细胞，各加入5 μL Annexin V-PE和7-AAD，室温环境中避光孵育20 min，使用流式细胞仪在586/42nm AV-PE和527/32 nm 7-AAD条件下进行细胞凋亡分析并定量,凋亡细胞通过早期凋亡和晚期凋亡总和(LR+UR)表示。

1.2.5 RNA高通量测序 提取的总RNA样品送至上海康成公司，经琼脂糖电泳及Nanodrop质检和定量后，用oligo(dT)磁珠富集mRNA；RNA测序文库由试剂盒完成，用 Agilent 2100对RNA文库进行质检，并由qPCR方法进行文库定量，使用 Illumina Hiseq 4000 测序仪进行测序。

1.3 统计分析 数据应用SPSS 17.0 软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间数据采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染miR-199b-5p mimics后足细胞中miR-199b-5p的表达 细胞转染48 h后使用qRT-PCR检测足细胞中miR-199b-5p表达水平结果显示，与NC组(1.00±0.08)相比，转染miR-199b-5p mimics足细胞中miR-199b-5p的相对表达水平(12.17±0.31)较NC组升高，差异有统计学意义(t=71.084，P<0.05)(图1)。

NC：空载对照组；mimics：过表达组；*P<0.05vsNC组。

图1 足细胞中miR-199b-5p的相对表达水平

2.2 过表达miR-199b-5p对足细胞凋亡的影响 无血清培养基培养足细胞48 h诱导足细胞损伤，流式细胞仪检测足细胞凋亡结果显示(红色框内)：对照组足细胞凋亡率为(32.97±1.45)%，过表达mimics组为(25.51±0.94)%，与NC组相比，过表达miR-199b-5p可以抑制足细胞凋亡，差异有统计学意义(t=8.521，P<0.05)，见图2。

2.3 基因表达谱变化 高通量测序基因表达谱显示，过表达 miR-199b-5p足细胞中较NC组的基因差异表达，红色表示上调基因，绿色表示下调基因(图3A)；与NC组相比，过表达 miR-199b-5p后，有11 114个基因表达发生变化，其中106个基因下调大于1.5倍，99个基因上调大于1.5倍(图3B)。

2.4 基因功能富集分析 对下调大于1.5倍的基因进行基因功能(GO)和信号通路(Pathway)富集分析来鉴定这些差异表达基因功能，采用DAVID数据库的GO方法工具了解差异基因的生物学过程和途径。根据分析结果显示，这些基因丰富了转录的生物学过程，参与了NF-κB和TNF信号通路的调控、肌动蛋白骨架构成、细胞周期、凋亡、自噬等多方面(图4)。

NC：空载对照组；mimics：过表达组；*P<0.05vsNC组。

图2 过表达 miR-199b-5p对足细胞凋亡的影响

NC：空载对照组；mimics：过表达组。

图3 过表达mimics组和对照组NC基因表达变化

A.生物过程；B.细胞组成；C.分子功能；D.信号通路。

图4 下调基因功能富集分析

3 讨论

足细胞损伤是多种肾脏疾病共有的病理生理变化，广泛存在于微小病变性肾病、局灶节段性肾小球硬化、IgA肾病等肾脏疾病中[5]，遗传、机械、免疫应激以及毒素在内的许多因素都可引起足细胞损伤[6]，足细胞长期持续损伤会引起肾小球的减少，最终导致肾脏功能的丧失。

近年来miR-199b-5p被广泛研究，其在红细胞产生[7]，髓母细胞瘤[8]中都有重要调节作用。在本研究中，过表达miR-199b-5p可提高足细胞存活力，减少足细胞凋亡，这一研究结果初步提示miR-199b-5p过表达在足细胞凋亡中的保护作用。为进一步阐述miR-199b-5p保护足细胞的分子机制，通过高通量测序检测miR-199b-5p mimics组和NC组足细胞中基因表达谱变化。结果显示，与NC组比较有11 114个差异表达基因，其中106个基因下调大于1.5倍，考虑到miRNAs主要通过抑制靶基因的表达发挥其生物学功能，因此主要针对下调的基因进行功能富集分析，结果发现，这些潜在靶基因可能通过NF-κB和TNF信号通路、调控肌动蛋白骨架稳定性、细胞周期、凋亡等多个方面参与对足细胞凋亡的保护作用。

通过 TargetScan和miRDB数据库预测miR-199b-5p的靶基因，结合高通量测序结果中下调的差异基因，发现miR-199b-5p可能通过不同的靶基因在细胞凋亡过程中发挥调节作用：①UBL3是一种泛素样蛋白，Verma等[9]在细胞黏附、细胞骨架组织的通路中发现UBL3基因的改变。肌动蛋白细胞骨架的稳定对维持正常足细胞结构起着至关重要的作用，肌动蛋白细胞骨架的重排是蛋白尿发生的关键，导致肾脏疾病进行性加重[10]。②靶基因脂肪细胞质膜相关蛋白(APMAP)在脂肪细胞分化中发挥重要作用[11]，另外，APMAP在NF-κB信号通路中也有重要调控作用，下调APMAP可以促进NF-κB信号通路的激活[12]，NF-κB信号通路的激活可降低TNF诱导的细胞凋亡，而在NF-κB活性缺乏的情况下，TNF诱导的细胞凋亡的敏感性将显著增加[13]。③G蛋白信号传导(RGS)蛋白超家族具有巨大的结构和功能多样性，与细胞功能及疾病发生有着密切相关性[14]。RGS10是RGS家族中较小的一个，在多个组织中都有表达，研究发现，敲低RGS10可以促进肿瘤细胞的生长、存活，减少细胞凋亡[15]，提示了下调RGS10在细胞凋亡中的保护作用。同时，Altman等[16]发现，抑制RGS10可以诱导mTOR信号通路的激活，激活的mTOR可以通过Akt途径提高细胞存活率，减少细胞凋亡。

综上表明，过表达miR-199b-5p可能在足细胞损伤中发挥重要保护作用，通过对靶基因表达的调控，影响NF-κB、TNF、mTOR等信号通路，调控肌动蛋白骨架稳定等多个方面抑制足细胞的凋亡。目前还尚未报道miR-199b-5p与足细胞损伤相关方面的研究，而本研究可以帮助阐明miR-199b-5p在肾脏足细胞损伤中的调控作用，提供新的研究方向，尽可能地为各种因足细胞损伤引起的肾脏疾病提供干预方案。