响应面法优化龙牙百合多糖的高温高压水提取法工艺

蓝海军，何美娟，罗晨曦，毕双同

(1.江西赣粮实业有限公司 院士工作站，江西 南昌 330200；2.江西省儿童医院 呼吸内科，江西 南昌 330006)

龙牙百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)是我国经济型食用百合中的优良品种，因其个大、鳞片狭长且肥厚、状若龙爪、色白若象牙，故名为“龙牙百合”[1]，以江西万载、永丰和湖南隆回3地所产尤为知名[2]。龙牙百合主要可食用部分为地下鳞茎，其营养价值和药用价值都很高，特别在呼吸道疾病的防治方面有积极效果，是我国首批药食两用植物之一。目前百合除被大量用作日常食用外，还可加工成百合粉、百合饮料、百合干、百合饼干和百合罐头等[3]。

百合中含有丰富的多糖、多酚、黄酮和皂苷等活性成分[4-7]，其中百合多糖是百合的主要活性功能成分之一，研究发现其具有消炎、抗疲劳、抗抑郁、降血糖和抗氧化等作用[5-9]。刘成梅等[10]发现百合多糖对四氧嘧啶引起的高血糖小白鼠有明显的降血糖功能；李化强等[5]发现龙牙百合粗多糖的清除能力强于精制多糖，但均弱于维生素C。

百合多糖的提取方式决定了其纯度、结构和活性，目前国内外主要的提取方式有热水浸提、微波辅助提取、超声波辅助提取、酶法和酸碱法等。例如熊明郁等[11]用水提法提取百合多糖；张占军等[12]用超声辅助提取百合多糖；Zhao等[13]采用微波辅助提取百合多糖；高清雅等[14]用超声波和酶协同作用提取百合多糖。这些方法各有优缺点。热水提取法成本低、操作简单，但存在时间长、提取效率低的缺点。微波和超声波法时间短、溶剂消耗量小、效率高，但须要专门设备，产业化成本和难度较高。酶法绿色、快速，但是酶制剂成本较高。高温水提法具有快速、高效等优点，但目前对其提取百合多糖的研究还较少。

因此，本研究以江西宜春市万载县龙牙百合为原料，采用响应面法优化高压高温水提法提取百合多糖的工艺，以期为龙牙百合的开发利用提供一定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙牙百合，购自江西万载地区；浓H2SO4、苯酚和葡萄糖等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外分光光度计，日本岛津仪器公司；BT224S型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；TD型电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；RE52-A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SN510C型立式压力蒸气灭菌锅，重庆雅马拓科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 多糖的提取方法

龙牙百合清洗干净后，将其切成大小均匀的条状。称取10.0 g百合于250 mL锥形瓶中，按适当的料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，置于高压灭菌锅中，在一定条件下进行提取，冷却后，4 000 r/min离心15 min，抽滤取得滤液，将滤渣进行重复提取，合并滤液，置于旋转蒸发仪中浓缩定容至50 mL，得龙牙百合粗多糖溶液。

1.3.2 多糖提取得率的测定

参考熊明郁等[11]和张雪春等[15]的方法并稍作修改，精确移取1.0 mL粗多糖溶液，用蒸馏水稀释至100 mL。从稀释液中移取1.0 mL溶液加入干燥的带塞试管内，加入4.0 mL硫酸-苯酚溶液，轻微振荡均匀，置于沸水浴中反应30 min后迅速取出，用水冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光值。同时以不同质量浓度的葡萄糖溶液(0～100 μg/mL)代替样品与硫酸-苯酚溶液反应，绘制葡萄糖质量浓度与吸光度值的标准曲线，并按式(1)计算多糖得率。

(1)

式中：V为提取液体积，mL；ρ为提取液中多糖质量浓度，g/mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

1) 料液比对多糖得率的影响

固定提取温度120 ℃，时间1 h，次数2次，选取料液比(g/mL)分别为1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25和1∶ 30进行多糖提取，考察料液比对百合多糖得率的影响。

2) 提取温度对多糖得率的影响

固定料液比(g/mL)为1∶ 20，时间1 h，次数2次，选取温度分别为100、110、120、130和135 ℃进行多糖提取，考察提取温度对百合多糖得率的影响。

3) 提取时间对多糖得率的影响

固定料液比(g/mL)为1∶ 20，温度120 ℃，次数2次，选取时间分别为30、60、90、120和150 min进行多糖提取，考察提取时间对百合多糖得率的影响。

4) 提取次数对多糖得率的影响

固定料液比(g/mL)为1∶ 20，温度120 ℃，时间1 h、选取提取次数分别为1、2、3、4和5次进行多糖提取，考察提取次数对百合多糖得率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，选取对百合多糖得率影响较大的因素，采用Design Expert 8.05b软件进行Box-Behnken响应面设计，以百合多糖提取得率为响应值，优化后得最佳提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

根据葡萄糖质量浓度与测定的吸光度值绘制的标准曲线见图1。由图1可知：蒽酮显色后的吸光度值与葡萄糖质量浓度呈线性关系，其回归方程为Y=0.123 4+0.003 75X，R2=0.996，说明方程能较好地表示样品的葡萄糖质量浓度与吸光度之间的关系，可用于样品的测定。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对多糖得率的影响分析

料液比对百合多糖得率影响的曲线见图2。由图2可知：百合多糖得率随料液比增大而增大，在料液比(g/mL)为1∶ 20时，多糖得率为(6.21±0.04)%，此后继续增大料液比，多糖得率增大趋势不明显。可能是因为料液比(g/mL)在1∶ 20的条件下，百合组织中的多糖浸出已经较为充分[16]。此后再增大料液比，虽然多糖得率有所提高，但是提高程度较低，从实验时间、操作方便性和成本考虑，选取料液比(g/mL)1∶ 20为最佳试验条件。

图2 料液比对多糖得率的影响Fig.2 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取温度对多糖得率的影响分析

提取温度对百合多糖得率影响的曲线见图3。由图3可知：百合多糖得率随温度增大而呈现先增大后降低的趋势，在提取温度为120 ℃时，多糖得率最高为(6.20±0.09)%。原因是升高提取温度，对百合细胞破坏程度较大，有助于多糖在体系中的溶出。但温度过高，降低了百合表面的张力，增加了表面微气泡的蒸气压，反而降低了多糖的溶出效果[12]，因此，选取提取温度120 ℃为最佳试验条件。

图3 提取温度对多糖得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取时间对多糖得率的影响分析

提取时间对百合多糖得率影响的曲线见图4。由图4可知：随提取时间的延长，百合多糖得率不断上升，在90 min时多糖得率最大，达到(6.25±0.03)%，继续延长提取时间，多糖得率反而缓慢下降。原因是提取一定时间后，百合细胞膜内外的渗透浓度逐渐相等，多糖不再溶出，另外高温提取时间过长，对多糖结构可能有一定的破坏[17]。

图4 提取时间对多糖得率的影响Fig.4 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide

图5 提取次数对多糖得率的影响Fig.5 The effect of extraction times on the yield of polysaccharide

2.2.4 提取次数对多糖得率的影响分析

提取次数对百合多糖得率影响的曲线见图5。由图5可知：百合多糖得率随提取次数的增加而上升，提取2次时基本已被提取出来，此后继续增加提取次数，多糖得率呈缓慢上升趋势。因此，从工作量和成本考虑，选取2次为单因素试验最佳提取次数。

2.3 响应面试验

根据2.2节单因素试验的结果，固定提取次数为2次，选取料液比、提取温度和提取时间为试验因素，以百合多糖得率为试验响应值，设计三因素三水平响应面进行优化试验，因素水平表和响应面分析试验根据文献[15]设计，其结果见表1和2。

表1 响应面因素及水平表

通过Design Expert 8.05b软件对表2中的试验结果进行响应面回归分析，得到该试验的回归模型方程Y′=6.374+0.221 25A+0.072 5B+0.081 25C+0.022 5AB-0.04AC-0.007 5BC-0.034 7A2-0.329 5B2-0.267 8C2。模型系数显著性结果和方差分析结果见表3和4。

表2 Box-Behnken试验设计和结果

表3 回归模型方差分析和系数显著性检验

表4 方差分析表

由表3可知：该模型的P值极显著(P<0.000 1)，R2=0.975 6，表示方程能较好地反映各因子与响应值的关系，并预测最佳合成条件。失拟项P值为不显著，说明方程拟合度较好。各因素对试验影响程度由大到小依次为料液比(极显著)、时间(显著)、温度(显著)。

各因素之间交互作用对百合多糖得率的影响结果见图6。比较图6(a)、6(b)和6(c)之间可知：料液比与时间交互作用的曲线椭圆程度大于料液比与温度的交互作用，且大于温度与时间的交互作用。该结果与表3中影响因素A、C大于影响因素A、B，大于影响因素B、C，所得P值的结果也是一致的。

图6 各因素相互作用对多糖得率影响的响应面图Fig.6 Response surface of the effects of the operating parameters on the yield of polysaccharide

2.4 方程的求导和验证

通过响应面优化得到百合多糖最高得率为6.258%，利用Design Expert 8.05b软件对方程进行求导，得到最佳条件为料液比(g/mL)1∶ 24.98，温度121.44 ℃，时间92.25 min。为方便操作，取料液比(g/mL)为1∶ 25、温度121 ℃、时间92 min，对方程进行验证，在此条件下百合多糖得率为6.284%，接近预测值，证明该方程可行。

3 结论

采用高温水溶液提取百合中的多糖，经单因素试验表明，百合多糖提取的最佳条件分别为料液比(g/mL)1∶ 20，温度120 ℃，时间90 min，次数2次。在此基础上固定提取次数2次，选取料液比、温度和时间为变量，以多糖得率为响应值进行响应面优化试验，得到最佳提取条件为料液比(g/mL)1∶ 25，温度121 ℃，时间92 min。该条件下百合多糖得率为6.284%，明显高于文献报道所采用热水浸提法的0.92%。该方法简单、易操作，比较适用于百合多糖的提取。