酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白*

颜晓庆 ，刘庆亚 ，杨红宁 ，汤仁仙 ，寇艳波

（徐州医科大学1急救与救援医学系急诊医学实验室；2江苏省免疫与代谢重点实验室，江苏221004）

肝癌（hepatocellular carcinorma，HCC）是目前全球范围内发病率和致死率最高的癌症之一。53%的肝癌与乙肝病毒（heptitis B virus，HBV）感染有关[1]。乙肝病毒X蛋白（hepatitis B hirus X protein，HBX）的表达是HBV诱发肝癌最关键的因素，与肝癌的发生具有极其密切的关系[2]。HBX不仅能够反式激活许多癌基因的表达，还能作为辅激活物参与转录调控，甚至可以引起细胞信号通路的异常抑制或激活[3－4]，最终促进HCC的发生，但HBX诱发肝癌的具体分子机制并不完全清楚。HBX是一个多功能蛋白，能够通过与功能执行蛋白的直接结合调节其活性，而且可以与一些转录因子相互作用间接调控某些功能执行蛋白的转录[5－6]。例如，HBX通过结合聚合酶PARP1，抑制DNA损伤修复复合物的募集，从而加速DNA损伤，最终引发肝癌[7]。HBX还能与进化保守的信号转导通路中的中间产物相互作用，影响NFκB信号通路激活而调控肝癌的发生和发展[8]。除此之外，HBX还能够间接地影响其他重要信号通路，促进肝癌发生[9－10]。

早期，研究者们已经利用酵母双杂交系统筛选HBX相互作用蛋白，如HBX与蛋白酶体α亚基、DNA结合蛋白UVDDB、电压依赖的离子通道HVDAC3等的相互作用均是通过酵母双杂交文库筛选发现的[11-15]。但是由于早期技术手段的限制，并不能有效筛选HBX相互作用蛋白。为筛选鉴定新的HBX相互作用蛋白，我们以HBX为诱饵蛋白，将其与GAL4 DBD融合表达。同时，将新一代人肝脏均一化cDNA文库克隆至AD区表达载体pGADT7中，通过酵母双杂交筛选得到多个潜在的HBX相互作用蛋白。进一步验证及生物学功能探究将为阐明HBX促进肝癌发生发展的机制起到重要的推动作用，也将为防治乙肝病毒所引起肝癌的药物的开发提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 酵母双杂交系统包括报告菌株Y2HGold，表达载体pGBKT7和pGADT7，阳性对照组菌株P53-T由本实验室保存。均一化的Mate&Plat Library-Human Liver酵母文库（Takara公司）。高保真DNA聚合酶Primer Star（Takara公司）。预混2×Taq Master Mix DNA聚合酶（百泰克生物科技有限公司）。限制性内切酶EcoRI和PstI，T4 DNA连接酶（Thermo Fisher）。X-Gal、酵母培养基（上海生工生物工程有限公司）。酵母营养缺陷型培养基添加物（Yeast synthetic drop-out medium supplements）（Sigma）。酵母菌质粒提取试剂盒（Omega）。酵母菌转化试剂盒（北京酷来搏科技有限公司）。HBX一抗（Millipore）。

1.2 方法

1.2.1 诱饵蛋白HBX表达质粒构建：由NCBI数据库获得HBX编码序列，利用引物设计软件Primer 5.0获得HBX扩增引物：HBX-F：5’CCGGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC 3’，HBX-R：5’AAAACTGCAGTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCAT 3’。以本实验室保存的pcDNA3.1-HBX为模板，利用引物HBX-F和HBX-R进行PCR扩增得到HBX编码序列。PCR产物经除盐纯化后，通过限制性内切酶EcoRI和PstI消化并连接至诱饵蛋白表达载体pGBKT7。经酶切验证和测序后，获得HBX表达质粒pGBK-HBX。

1.2.2 酵母菌转化：过夜培养的酵母菌接种至新鲜培养基中，使OD600为0.15～0.3。继续培养2～3小时至 OD600为 0.4～0.6，4 ℃，700 g，5 min 离心收集菌体。菌体经无菌去离子水洗涤后，利用LiAc法（按照操作手册进行）制备感受态，并通过热激法将质粒转化至酵母菌体内。转化子经酵母菌菌液PCR和Western Blot验证后用于后续实验。

1.2.3 酵母菌菌液PCR：取过夜培养的酵母菌菌液100 μL，700 g离心 2 min，弃掉上清后，菌体用 100 μL 50 mM 的NaOH重悬，95℃加热10 min。加入10 μL Tris-HCl（1 M，pH 8.0）中和后作为模板进行PCR检测。

1.2.4 自激活和自毒性验证：以表达HBX的重组酵母菌转入空质粒pGADT7，得到自激活和自毒性检测菌株。分别通过营养缺陷平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Aba和 SD/-Leu/-Trp）划线和梯度稀释点板的方法检测HBX的自激活活性和自毒性。

1.2.5 cDNA文库筛选：以表达HBX的重组酵母为受体菌，Mate&Plat Library-Human Liver酵母文库为供体，通过Mating的方式（按照操作手册进行）筛选HBX相互作用蛋白。初步筛选条件为SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade，复筛条件为 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Aba，其中 X-α-gal浓度为 40 μg/mL，Aureobasidin（Aba）浓度为 200 ng/mL。将复筛呈蓝绿色，长势良好的转化子接种至液体培养基中，培养20～24 h后提取酵母质粒。所得酵母质粒经大肠杆菌扩增后提取质粒，得到携带目的片段的pGADT7-cDNA。质粒测序后获得编码与HBX相互作用蛋白的基因序列。

1.2.6 Western blot：菌体破碎上清液经蛋白浓度测定后，每孔上样总蛋白30 μg进行SDS-PAGE，转印至PVDF膜后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用HBX一抗4℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h再次洗涤后分析目的蛋白的存在。

2 结 果

2.1 诱饵蛋白HBX表达菌株的构建 HBX编码序列经EcoRI和PstI酶切后连接进入诱饵蛋白表达载体pGBKT7，重组质粒经BamHI和PstI双酶切得到438 bp和7.3 kb大小的片段（图1A），与理论分析一致，再经测序分析，序列无误后命名为pGBK-HBX。将pGBK-HBX通过LiAc法转化进入受体酵母Y2HGold，经营养缺陷筛选（不含色氨酸）得到诱饵蛋白HBX表达菌株Y2H-HBX；同时将pGADT7和pGBKT7、pGADT7 和 pGBK-HBX、pGAD-T 和 pGBK-p53分别转化进入Y2HGold得到阴性对照菌株Y2H-AD-NC、自激活和自毒性检测菌株Y2H-ADHBX和阳性对照菌株Y2H-T-P53。各重组酵母菌菌液PCR和Western blot验证结果如图1B和C所示。通过以上实验我们成功获取了诱饵蛋白表达菌株Y2H-HBX，阴性对照菌株Y2H-AD-NC、自激活和自毒性检测菌株Y2H-AD-HBX和阳性对照菌株Y2H-T-P53。

图1 Y2H-HBX菌株的构建

2.2 HBX自激活活性和自毒性检测 酵母双杂交筛选过程中，首先需要保证诱饵蛋白没有自激活活性也没有明显的自毒性，因此本实验利用平板划线和梯度稀释点板实验进行了HBX自激活活性和自毒性检测。分别通过SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-β-Gal/Aba培养基进行自激活活性检测，通过SD/-Leu/-Trp营养缺陷培养基进行HBX自毒性检测。结果如图2A和C所示，HBX单独存在时四个报告基因（his3、ade2、aur1-c、mel1）均不能被激活，说明 HBX没有自激活活性。HBX的表达也不影响Y2HGold的生长（图2B和D），说明HBX也没有自毒性。综合以上结果可得出结论，HBX可以作为诱饵蛋白进行cDNA文库筛选。

图2 Y2H-HBX自激活活性和自毒性检测

2.3 cDNA文库筛选HBX相互作用蛋白 将Y2HHBX（α型）与 Mate&Plat Library-Human Liver文库（以a型的Y187为受体菌）Mating后，经SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板初步筛选后将长势良好（报告基因his3启动），颜色较白（报告基因ade2启动）的转化子通过划线转移至SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba平板上进行复筛，将复筛蓝绿色，长势良好的转化子经酵母质粒提取、大肠杆菌扩增和质粒测序得到HBX相互作用蛋白基因序列。

本次cDNA文库筛选过程中，通过平板计数得到以下数据：诱饵蛋白表达菌理论菌落数为8.12×1010，文库菌理论菌落数为1.18×1010，Mating菌落数为2.97×108。文库菌落数是限制因素，因此Mating效率为 Mating菌落数/文库菌落数，即（2.97×108）/（1.18×1010）=2.51%>2%，本次文库筛选 Mating效率合格。本次筛选总共得到阳性转化子56个，质粒测序结果分析显示编码11种蛋白（表1）。将这些质粒重新转化至 Y2H-HBX，表明 X11、X17、X31、X34、X47所编码的5个蛋白在酵母双杂交系统中能够与HBX相互作用。

3 讨 论

我国是乙肝大国，乙肝病毒感染最终导致肝癌发生的临床案例更是多不胜数。深入了解乙肝病毒感染导致肝癌发生的分子机制，将为寻找治疗乙肝病毒相关肝癌药物的靶标提供可靠的基础。HBV感染是诱发肝癌的最重要因素，上世纪已有统计表明HBV感染的人群肝癌发病率要高于HBV阴性人群200多倍[16]。HBV感染促进肝癌发生发展的假说很多，如HBV感染后病毒复制导致胞内代谢紊乱，HBV基因整合至肝细胞基因组中引起某些基因的错误表达等。其中最被研究者们所公认的就是HBV编码的蛋白通过改变宿主细胞基因表达模式及改变胞内信号通路的活化状态而促进肝癌的发生和发展。完整的HBV基因组由四个相互重叠的开放阅读框构成，分别是S、P、C和X[17]。其中S主要编码表面抗原，是乙肝病毒感染检测的重要指标；P主要编码乙肝病毒复制的关键酶-乙肝DNA多聚酶；C主要编码核心抗原和E抗原，是构成完整病毒颗粒不可缺少的成分；X编码HBX蛋白，HBX除参与调控乙肝病毒复制外，还影响着肝癌的发生[18]。研究表明HBX不仅能激活原癌基因，还能够以辅激活物的形式调控转录因子活性，影响基因转录，甚至可以改变胞内信号通路的活化状态[19-22]。因此，阐明HBX促进肝癌发生发展的机制将是研究乙肝病毒感染所引起的肝癌的重中之重。由于HBX本身没有DNA结合活性，所以鉴定与HBX直接相互作用的蛋白，并明确HBX与该蛋白结合后所介导的生物学过程是阐明HBX促进肝癌发生发展机制的关键点。

酵母双杂交cDNA文库筛选是一种常用的鉴定蛋白相互作用的方法[11]。做酵母双杂交cDNA文库筛选实验时，分别将目的蛋白与酿酒酵母转录因子GAL4的DBD区（DNA binding domain）融合表达，将cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区（activation domain）融合表达。若目的蛋白能与文库编码的蛋白结合，则可使各自融合的GAL4 DBD区和AD区靠近，形成完整有活性的GAL4，启动报告基因表达[12]。酵母双杂交cDNA文库筛选相互作用蛋白具有敏感性高，操作步骤相对简单，应用范围广，筛选通量大等特点。本研究通过酵母双杂交cDNA文库筛选鉴定了HBX相互作用蛋白。文库筛选采用Mating的方法，效率为2.5%超过2%，Mating效率合格，表明筛选覆盖面较完全。自激活活性检测和自毒性活性检测结果显示HBX本身在酵母中没有明显的自激活活性，也没有自毒性，说明其作为诱饵蛋白是合理可靠的。经筛选及初步鉴定，得到5个潜在的HBX相互作用蛋白，进一步的验证及生物学功能探究将为阐明HBX促进肝癌发生发展的分子机制起到积极的推动作用。

本研究中通过酵母双杂交cDNA文库筛选，虽然得到了5个潜在的HBX相互作用蛋白（具体蛋白信息见表1），但是由于酵母双杂交系统有自身诸多的不足，如：强制使文库编码的蛋白入核，使自然状态下空间分布不可能在一起的两个蛋白相互作用呈阳性；检测过于灵敏，酵母双杂交系统采用高拷贝和强启动子的表达载体使诱饵蛋白和文库编码的蛋白均处于过表达状态，易将信号过分放大；此外，蛋白共定位也可激活报告基因，比如诱饵蛋白和待检测蛋白没有物理上的直接相互作用，但是如果这两个蛋白在空间定位上足够靠近也容易产生假阳性的结果。因此，筛选得到的这些潜在的HBX相互作用蛋白还需要通过进一步的验证，如通过免疫共沉淀或荧光共振能量转移等实验来验证这些蛋白在肝细胞或肝癌细胞内是否真正能与HBX相结合。此外，也可将HBX免疫沉淀后，将共沉淀产物进行蛋白质谱检测来寻找HBX相互作用蛋白。此法不能有效排除非直接性相互作用，但是，可通过酵母双杂交来进行验证，排除非直接性相互作用。

本研究中通过酵母双杂交系统结合新一代肝脏均一化cDNA文库并没有筛选得到已报道的HBX相互作用蛋白，可能原因如下：（1）早期研究中通过酵母双杂交文库筛选得到的HBX相互作用蛋白多为肝脏中高表达的蛋白，如蛋白酶体α亚基、UVDDB1和HVDAC3；（2）许多研究者通过免疫沉淀和质谱鉴定的手段也得到了多个HBX相互作用蛋白，但是这些蛋白与HBX的相互作用未必是直接相互作用，而酵母双杂交系统只能鉴定HBX的直接相互作用蛋白，因此本次筛选没有得到这类已报道的HBX相互作用蛋白。值得注意的是Lwa等[23]曾报道GNB5（guanine nucleotide binding protein β5 subunit）能够与HBX相互作用。GNB5与本研究中筛选得到的GNB2L1均属于WD repeat蛋白家族，氨基酸序列上有较大的相似性，GNB2L1极有可能是HBX的直接相互作用蛋白。

前期的临床研究数据显示病毒性肝炎或中毒性黄疸型肝炎患者血清葡萄糖磷酸变位酶活性明显升高，并且早期还有研究表明，红细胞来源的葡萄糖磷酸变位酶 1（Phosphoglucomutase-1，PGM1）还可作为急性淋巴细胞白血病患者骨髓移植预后的重要指标[24]；乳腺癌易感基因BRCA的异常则与乳腺癌和卵巢癌密切相关[25－26]，BRCA是基因组完整性的动态调节者，BRCA在DNA损伤修复和某些基因的表达调控中发挥非常重要要的作用，它们功能的异常可以导致基因突变的积累，最终会影响包括乳房和卵巢在内的多个器官的癌症的发生和发展[27]；鸟嘌呤核甙酸结合蛋白（guanine nucleotide-binding pro tein，GNB）β亚基过表达则能够引起细胞周期调控蛋白和细胞凋亡调控蛋白的异常表达，促进抗雌激素药物抵抗的乳腺癌细胞的增殖并能缩短它们的细胞周期[28]。结合其他学者的研究结果，我们有理由推测本研究筛选得到的5种蛋白中，至少葡萄糖磷酸变位酶 1（PGM1）、乳腺癌基因（BRCA）复合物亚基以及鸟嘌呤结合蛋白（GNB）与乙肝病毒感染或恶性肿瘤的发生发展有关。提示HBX可能通过与PGM1、BRCA1或GNB的相互作用改变它们的活性，从而调控自身在肝细胞中的存在或影响肝癌的发生发展。

HBX相互作用蛋白的筛选及进一步的验证，将鉴定得到肝细胞或肝癌细胞中与HBX直接相互作用的蛋白，深入分析HBX结合这些蛋白对它们功能的影响及影响机制，将有利于人们更加明确乙肝病毒在肝细胞中长期存在和促进肝癌发生的过程，也将为治疗乙肝病毒感染及防治乙肝病毒感染引起的肝癌的药物的开发研制提供新的靶点。