半夏泻心汤对肝郁模型大鼠cAMP、PKA水平以及单胺类神经递质的影响

潘嘉，宁楠，黄利，刘洁，刘亚欧，邓延莉，于娅，李利民

抑郁症(depression)是一种常见的情绪障碍综合征，由与潜在的生物学异常有关的症状和体征组成，以心境低落为主要特征。世界卫生组织估计全球约有抑郁症患者3.4亿，抑郁症终生患病率高达6.1%～9.5%。抑郁症所致伤残居各类疾病之首，严重危害人类身心健康，给社会造成巨大负担。所以，本病具有高患病、高复发、高致残、高医疗成本的特点[1]。

抑郁症属于中医的“郁症”范畴，与肝脏密切相关。中医认为，肝为刚脏，喜条达，恶抑郁，主疏泄。肝主疏泄功能失调日久则化为肝郁。肝郁一般由精神情志刺激引发，而精神情志发于脑，情志的调节多与脑内的去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）等密切相关。在我们过去的研究中发现：半夏泻心汤对脾虚大鼠脑组织单胺类神经递质有调节作用[2]。由此设想半夏泻心汤对肝郁可能具有一定影响，为验证上述设想，我们进行了半夏泻心汤对肝郁模型大鼠的影响实验，以探讨半夏泻心汤对肝郁模型大鼠的影响。

1 材料

1.1 试验药物

半夏泻心汤各组成药物均购自四川省中药饮片有限责任公司，其中炙甘草产于新疆，黄芩产于河北，人参产于东北，干姜产于四川，黄连产于四川，法半夏产于四川，以上药物均执行2010年国家药典标准，大枣产于新疆（自配）。按照生药剂量比例根据文献折算给药量，依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量，并扩大5倍。全方由半夏12 g，干姜9 g，黄芩9 g，黄连3 g，人参9 g，甘草9 g，大枣4枚组成，精确称取上述相应剂量的生药，加入10倍量清水浸泡30 min（人参提前浸泡24 h），常规煎煮2次，30 min/次，100目滤布过滤药液，2次滤液混合后，60℃水浴加热浓缩为每1 mL药液含1g生药的提取药液供给药用。

1.2 动物

SD大鼠，SPF级，60只，全雌，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（川）2013-19号，所有动物于室温18～22℃，相对湿度40%～70%，12 h明暗交替环境中进行实验。饲养一周后实验。

1.3 试剂

Rat Dopamine (DA) ELISA Kit，Rat Noradrenaline(NE) ELISA Kit;，Rat 5-hydroxy tryptamine (5-HT)ELISA Kit均为USA MyBioSource, Inc出品；大鼠环磷酸腺苷（cAMP） ELISA试剂盒，大鼠蛋白激酶A（PKA） ELISA试剂盒，由上海西唐生物科技有限公司生产；TotalRNAExtractor(Trizol), 100 mL/瓶，Lot:B921KAC166,有效期至：03/2017，生工生物工程（上海）股份有限公司；RevertAid First Satrand cDNA Synthesis Kit, Lot 00221108, Exp.07.2016,Thermo Scientific；SsoFastTM EvaGreen® supermix,Control 760000152,Exp 2016-12-14, BioRad；抗大鼠抗体脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophic factor，BDNF)，抗大鼠抗体DA受体（多巴胺受体），多聚体抗兔IgG-HRP，DAB显色试剂盒等，均由武汉博士德生物工程有限公司出品；盐酸氟西汀片（常州四药制药有限公司生产，批号20130701）。

1.4 仪器

Discovry XT全自动免疫组化染色系统，Roche；酶标仪，洗板机，Denly Dragon；光谱扫描式多功能读数仪，Thermo Fisher；实时定量PCR检测系统，BioRad CFX96；

2 方法

2.1 造摸及给药

SD大鼠随机分成6组：正常组、模型组、半夏泻心汤 (5，2.5，1.25 g·kg-1) 给药组，阳性对照盐酸氟西汀(4 mg·kg-1)组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠在颈部带上自制铁圈，铁圈宽度为12毫米。连续佩戴6周。6周后开始给药，正常组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水，阳性药组灌胃4 mg·kg-1的盐酸氟西汀，给药组分别按剂量灌胃半夏泻心汤。每天定时灌胃1次，连续灌胃4周。实验过程中每周称重一次，并根据最新体重调整给药体积。

2.2 糖水消耗实验[4]

分别于造模前、造模6周、给药2周和给药4周时进行4次糖水消耗量测定。实验时在安静的房间内训练动物适应喝糖水，第1天每笼放置2瓶糖水(1%蔗糖溶液)；第2天1瓶糖水，1瓶纯水，2瓶位置随机；第3天禁食禁水，第4天给每只大鼠随机放置2个水瓶，分别放置计量称重的1%蔗糖水和纯水，24小时后取2瓶水再次称重。记录每只大鼠的糖水和纯水的消耗量，计算糖水偏嗜度。

2.3 大鼠血清和脑组织海马区cAMP和PKA活性的测定

实验结束，参照文献[7]方法，麻醉动物腹主动脉取血后放血处死，迅速取脑，置冰盒上，取出大脑，分离左侧海马和皮层组织，分别称重，按重量和体积比1∶10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆。血液静置半小时后，和组织匀浆均在4℃，3500 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，参照试剂盒说明书立即测定cAMP和PKA活性。

2.4 大鼠海马DA、NE和5-HT含量的测定

取上述方法制备的海马区组织匀浆，按试剂盒说明书检测方法采用Elisa法检测DA、NE和5-HT含量。

2.5 大鼠额叶皮层DA和BDNF的含量检测

学习记忆测试结束后1h，动物腹主动脉取血后放血处死，迅速取脑，置于冰盒上，取出大脑，分离大鼠额叶皮层，迅速放入4%多聚甲醛固定液中，2天后常规石蜡包埋、切片、Roche全自动免疫组化染色系统染色。应用彩色病理图文分析系统获得高清晰的免疫组化染色病理图片（100倍）。使用Image Pro Plus7.0分析测量大鼠额叶皮层DA和BDNF的表达面积和累积光密度，用非参数法进行统计学分析。

3 结果

3.1 半夏泻心汤对肝郁大鼠糖水偏嗜度的影响

实验动物造模后，模型组大鼠蔗糖水的消耗量逐渐减少，对糖水偏嗜程度明显下降。半夏泻心汤给药4周后，半夏泻心汤给药组大鼠蔗糖水的消耗量逐渐增加，提示半夏泻心汤可明显提高大鼠对糖水的偏爱程度，实验结果具体见表1。

表1 半夏泻心汤对肝郁大鼠糖水偏爱百分比的影响(%，n=10)

3.2 半夏泻心汤对海马和血清cAMP和PKA的影响

与对照组比较，模型组动物海马区组织cAMP和PKA水平明显降低，而血清cAMP和PKA含量没有明显改变。与模型组比较，半夏泻心汤给药后，各给药组可明显提高海马区组织cAMP和PKA水平。实验结果具体见表2。

表2 半夏泻心汤对海马区和血清cAMP和PKA水平的影响

3.3 半夏泻心汤对海马区5-HT、DA和NA含量的影响

与对照组比较，模型组动物海马区组织5-HT和DA含量明显降低（P＜0.01），模型组大鼠海马组织NA含量与对照组基本一致，无明显改变。与模型组比较，半夏泻心汤给药后，大、中剂量组海马区脑组织内5-HT和DA含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01），氟西汀可升高海马脑组织DA和5-HT含量。实验结果具体见表3。

表3 半夏泻心汤对海马区5-HT、DA和NA含量的影响

3.4 半夏泻心汤对大鼠额叶皮层区DA和BDNF表达的影响

与对照组比较，模型组动物额叶皮层区DA和BDNF表达明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，半夏泻心汤3个剂量给药组额叶皮层区DA表达面积（Area）和累积光密度（IOD）均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），氟西汀也可提高额叶皮层区DA表达。与DA表达稍有不同的是，半夏泻心汤1.25 g·kg-1给药组额叶皮层区BDNF表达与模型组比较没有明显差异，半夏泻心汤2.5 g·kg-1和5 g·kg-1给药组额叶皮层区BDNF表达面积（Area）和累积光密度（IOD）均较模型组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。实验结果具体见图1、图2。

图1 半夏泻心汤对大鼠额叶皮层区DA表达的影响

图2 半夏泻心汤对大鼠额叶皮层区BDNF表达的影响

4 讨论

抑郁症是一种异质性病症，易损害认知功能，病程时长时短且容易复发。其临床表现为情绪低落，思维迟钝，言语动作迟滞，对任何事情都提不起兴趣等等；甚至悲观厌世，有自杀企图或行为；部分病例有明显的焦虑和紧张激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。人类抑郁症的核心症状即快感丧失。本试验采用的枷锁法使大鼠“郁怒而不能发”，从而情志所伤造成的肝郁证模型。而实验性动物抑郁的重要特征是对奖赏的反应性下降，目前国内外大多数学者采用液体消耗实验中糖水的消耗量和糖水偏爱百分比怍为衡量快感缺乏的有效的客观的指标[5]。本试验中采用双瓶实验来衡量液体消耗实验中的各项指标，结果模型组大鼠1%蔗糖水消耗量明显降低，蔗糖水偏爱百分比也明显下降。提示这种模型能基本反映动物对奖赏的反应能力的下降。半夏泻心汤给药4周后，给药组大鼠蔗糖水的消耗量逐渐增加，提示半夏泻心汤可明显提高大鼠对糖水的偏爱程度。

cAMP具有调节神经递质合成，增加CAMP浓度可以激活PKA，从而使某些基因调节蛋白磷酸化，进而激活特定的基因转录。模型组动物海马区组织cAMP和PKA水平明显低于对照组，而血清中cAMP和PKA含量没有明显改变。半夏泻心汤给药后与模型组比较，各给药组都明显提高海马区组织cAMP和PKA水平。中枢神经系统中单胺类递质代谢紊乱是抑郁症的主要生化特征，5-HT、NA、DA为重要的单胺类中枢神经递质，参与情感、睡眠、记忆、食欲和性功能的调节。模型组动物海马区组织5-HT和DA含量明显低于对照组，模型组大鼠海马组织NA含量与对照组基本一致，无明显改变。半夏泻心汤给药后，与模型组比较，大、中剂量组海马区脑组织内5-HT和DA含量明显升高。说明半夏泻心汤可显著提高肝郁证大鼠脑组织中单胺类递质的含量。

DA主要负责大脑的情欲、感觉，将兴奋及开心的信息传递。一旦多巴胺分泌减少，向下传递的信号就无法很正确地传递到肢体，这个时候我们执行的命令就可能是错误的，或者根本没有受到大脑控制。而BDNF有保护神经元，抵抗损伤及促进神经元修复作用，脑内BDNF的缺少，大脑相应功能的紊乱则会导致抑郁。模型组动物额叶皮层区DA和BDNF表达明显低于对照组。与模型组比较，半夏泻心汤3个剂量给药组额叶皮层区DA表达面积（Area）和累积光密度（IOD）均明显升高，氟西汀也可提高额叶皮层区DA表达。与DA表达稍有不同的是，半夏泻心汤1.25 g·kg-1给药组额叶皮层区BDNF表达与模型组比较没有明显差异，半夏泻心汤2.5 g·kg-1和5 g·kg-1给药组额叶皮层区BDNF表达面积（Area）和累积光密度（IOD）均较模型组明显升高。可见，半夏泻心汤对肝郁模型大鼠CAMP、PKA水平以及DA等都是有升高作用的，具有抗抑郁的作用。