良附丸的HPLC指纹图谱研究

卢君蓉，李文兵，王世宇，傅超美

良附丸为中药传统成方制剂丸剂的代表品种之一，是高良姜、醋香附两味中药等份、粉碎、混合而制成的水泛丸，功善温胃理气，在中医临床上用于寒凝气滞胃脘疼痛之证，症见寒凝气滞、脘腹吐酸、胸腹账满等[1]。据文献调研，良附丸被先后研制成多种不同剂型的新制剂，如良附口服液[2]、良附口服微乳[3]、良附颗粒[4]、良附胃漂浮片[5]、良附滴丸[6]、良附软胶囊[7]等，且其抗炎、镇痛和抑制应激性胃溃疡等效果相当于或优于原水泛丸制剂[8-11]。然而，良附丸及其新研发制剂质量控制多以α-香附酮的含量为指标，仅反映了制剂中醋香附药材的成分，高良姜药材所含成分的体现较少。HPLC指纹图谱不仅能够全面地表征单味中药材的细微差别，还能够更加全面的表征制剂及其生产各关键环节中各药材成分，更加符合中药多成分、多层次、多靶点的复杂特性[12-14]，对经典传统制剂的纵向深入研究及横向二次开发均具有非常重要的意义。在前期研究香附醋制前后化学成分变化及建立同时检定良附丸中高良姜素、圆柚酮、ɑ-香附酮等5种特殊性成分的基础上[15,16]，探索建立良附丸HPLC指纹图谱控制模式，以更加全面地反映制剂特征，进一步完善良附丸质量标准提供参考，为加快其二次开发奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1200 Series高效液相色谱仪（G1312B四元梯度泵、G1322A脱气机、G1316B柱温箱、G1329B自动进样器、G1315C二极管阵列紫外检测器），赛多利斯Bp211DAG电子天平（德国Sartorius），超声波清洗器KQ5200DB（昆山市超声仪器有限公司）。

高良姜素（中国药品生物制品检定所，批号111699-200501），α-香附酮（江西本草天工科技有限责任公司，批号1443-080529），香附烯酮（自制，纯度＞98%），良附丸（北京同仁堂制药有限公司，批号分别：2083024、2083025、3088042、3082248、3083042、4082082、4082083、4082085、15081216、15081311）。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250×4.6 mm，5μm）；流动相：A：0.2%磷酸溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1；检测波长：242 nm；记录时间：45 min；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液制备

取高良姜素、香附烯酮、α-香附酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含高良姜素、香附烯酮、α-香附酮分别为0.25、0.05、0.02 mg混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取良附丸粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 µm）滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 仪器精密度试验 取同一批良附丸粉末（批号：2083024），精密称定，按2.3项下制备供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD分别0.01%～0.03%和0.02%～0.12%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批良附丸粉末（批号：2083024），精密称定，按2.3项下制备供试液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h进样，记录色谱图。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化, RSD分别0.02%～0.05%和0.03%～0.20%，表明样品24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批良附丸粉末（批号：2083024），精密称定，按2.3项下制备供试液，记录指纹图谱。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD分别0.01%～0.08%和0.04%～0.16%，表明重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰确定 取10批良附丸粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样10μL，记录色谱图。在供试品色谱中，共确定10个共有峰，其中2号峰（S峰）为高良姜药材中主要指标性成分高良姜素；6、7号色谱峰分别为香附药材中主要成分香附烯酮和α-香附酮。结果见图1。

图1 良附丸HPLC指纹图谱

2.5.2 指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积 以2号峰（高良姜素）作为内参比峰，计算各色谱峰与内参比峰的保留时间及峰面积比值，得各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值。结果表明，10批良附丸样品相对保留时间RSD在0.01～0.02%，相对峰面积在RSD在2.83～19.92%。

表2 10批良附丸指纹图谱相对保留时间

表3 10批良附丸指纹图谱相对峰面积

2.5.3 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）》对10批良附丸指纹图谱进行相似度分析。结果各批次良附丸指纹图谱相似度在0.956～1.000之间，说明相似度良好。结果见表4和图2。

表4 10批良附丸指纹图谱相似度计算结果

图2 10批良附丸指纹图谱叠加图

3 讨论

3.1 检测波长的选择

本试验采用二级阵列检测器（DAD检测器），对良附丸样品溶液进行了全波长扫描（190～400 nm），并具体考察了235 nm、242 nm、254 nm、266 nm、280 nm、320 nm、360 nm、400 nm等8个波长，综合考虑良附丸指纹图谱色谱峰数量和质量,最终以242 nm处基线平稳，溶剂干扰少,检测的图谱信息量最多且峰形较好,故选择242 nm作为指纹图谱的测定波长。

3.2 流动相的选择

流动相分别考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液系统等多个系统，并进行梯度洗脱比较,结果表明,在乙腈-0.2%磷酸溶液在表1的流动相条件下所得色谱峰峰形较好，且分离度高，故选择乙腈-0.2%磷酸溶液的梯度洗脱条件。

3.3 色谱峰的标定与指认

本试验建立了良附丸制剂HPLC指纹图谱，标定了8个共有色谱峰，并通过对照品比对等指认了其中3个共有峰，分别为高良姜素（2号）、香附烯酮（6号）和α-香附酮（7号）。该HPLC指纹图谱具有方法简单、重复性好等优点，能够更加全面地反映良附丸制剂特征，为完善良附丸质量标准提供参考。