霍山石斛内生真菌抗病原真菌研究

岳婧怡

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽 芜湖 241000)

郁阳

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

汤强，童传旺，徐迪，王巨龙

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽 芜湖 241000)

内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内真生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生真菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系。这种关系决定了内生真菌对宿主植物具有促生抗逆(抗干旱、抗病虫害等)以及有效成分合成积累的独特生物学特性。目前，已有学者[1～4]从药用植物内生真菌中，筛选分离出大量具有较强抗农作物病害活性的内生真菌及其代谢产物。从药用植物内生真菌中寻找和发现抗病原真菌有效活性成分，为新型生物农药的研究和开发提供了新的途径。

石斛属常见病害主要有黑斑病、炭疽病、霜霉病、灰霉病、白绢病[5,6]。其中炭疽病主要病原为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，主要为害石斛叶片，也为害茎部，幼苗、成株均可得病；黑斑病病原菌为交链孢真菌细极链格孢菌Alternariatenuissima，主要为害石斛叶；根腐病主要病原菌为立枯丝核菌Rhizoctoniasolani，主要为害石斛根部，导致根充水腐烂。目前对栽培石斛病害的防治主要依靠化学农药，这必然导致产品中农药残留检出甚至超标，危害药材品质。本研究通过前期对霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)内生真菌进行分离鉴定，分离得到6种内生真菌(Alternariaeichhorniae、Colletotrichumorchidophilum、Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Aspergillusflavus)，并对其进行抗病原真菌活性筛选，筛选得到活性较好的2株内生真菌，为后期寻找抗病原真菌(尤其对宿主植物致病真菌)活性先导化合物，揭示内生真菌与宿主植物活性成分之间的关系以及探索新颖的活性化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器与试剂

JJ-CJ-2FD 洁净工作台：吴江市净化设备总厂；MIKRO 22R 高速冷冻离心机：德国Hettick 公司；SHP-250 型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；LDZX-30KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂； DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.1.2培养基

内生真菌分离纯化采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)不含抗生素；内生真菌发酵采用马铃薯葡萄糖肉汤培养基(potato dextrose broth，PDB)。

1.1.3供试菌

霍山石斛内生真菌：Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Stagonosporopsisoculihominis、Alternariaeichhorniae、Aspergillusflavus、Colletotrichumorchidophilum。菌种保存于芜湖职业技术学院生物工程学院。

植物病原真菌：小麦纹枯菌(Rhizotoniacerealis)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)、烟草蛇眼(Cercosporanicotianae)、茄子茎枯菌(Corynesporamelongnae)、玉米圆斑菌(Bipolariscarbonum)、牡丹炭疽菌(Colletotrichumsp.)、茄子棉疫(Phytophthoraparasitica)。7 种植物病原真菌由安徽中医药大学天然药物化学教研室提供。

石斛病原真菌：立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniCFCC)、极细交链孢菌(AlternariatenuissimaCFCC)、胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesCFCC)。3种病原真菌由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 方法

1.2.1供试菌发酵液制备

将保存在斜面试管的6种供试菌在无菌环境下接种于PDA 培养基中，置于恒温培养箱中28℃避光培养5～7d，用打孔器取直径为6mm 的菌饼接种于盛有200mLPDB 液体培养基的500mL锥形瓶中，置于28℃摇床(180r/min)培养5～7d 后，减压过滤，得滤液，即为6种供试菌的发酵液。取发酵液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，得到6种供试菌发酵液乙酸乙酯萃取物。取一定量萃取物浸膏置容量瓶中，加入微量的二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，无菌水定容，配制成1mg/mL 浓度药液。

1.2.2抑菌试验

采用菌落生长速率法进行。取1mL 供试药液，实验前用0.22μm 微孔滤头滤过，与9mL的PDA 培养基于无菌试管中混匀，倒入无菌培养皿中制成含药培养基平板，以DMSO 和无菌水作空白对照。将病原真菌菌种接种于PDA 培养基平板上活化5～7d 后，用无菌打孔器在活化完全的病原真菌菌落边缘打下6mm 生长一致的菌饼。将打好的菌饼菌丝面向下，接于培养基平板中心，封口，置于28℃恒温培养箱培养5～10d。每个试验平行重复3次。

抑菌结果采用十字交叉法[7]判定。待空白对照菌落长至平板边缘时，即可测量各培养皿中菌落直径，以3 次重复菌落直径的平均值计算菌丝生长抑制率I。

I=[(C-T)/(C-6)]×100%。

式中：C为空白对照菌落生长直径，mm；T为处理菌落生长直径，mm；6为菌饼直径，mm。

2 结果与分析

由表1可知，菌种Aspergillusflavus乙酸乙酯萃取液对10种病原真菌抑菌效果最差，Colletotrichumorchidophilum仅比Aspergillusflavus抑菌活性好，其他4种菌种乙酸乙酯萃取液对10种病原菌效果各有优劣，其中菌种Stagonosporopsisoculihominis对10种病原真菌平均抑菌率达到50%以上，尤其是对油菜菌核抑菌率高达90%；Alternariaeichhorniae相比其他菌种对3种石斛致病菌都有一定的抑菌率，且高于其他病原真菌抑菌率；Fusariumlactis对立枯丝核病原真菌抑菌率达到了100%；Phyllostictaaristolochiicola对10种病原真菌都具有一定的抑制作用。

表1 6种内生真菌对10种植物病原真菌体外抑制率

注：“-”表示染菌严重导致无法测得实验数据。

就3种霍山石斛致病菌来说，Alternariaeichhorniae和Colletotrichumorchidophilum对其有广谱抑菌效果，而Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis和Phyllostictaaristolochiicola对其中立枯丝核菌抑菌率都高达70%以上，尤其是Fusariumlactis对其抑菌率为100%。

3 讨论

内生真菌是一类应用前景广阔的微生物资源，在探讨药用植物内生真菌多样性的同时，往往能从所分离得到的内生真菌中筛选出与宿主植物相似活性(抗菌抗氧化等)或者促生抗逆活性较好的菌株[8～10]。本研究选取了霍山石斛内生真菌，对其发酵液进行抗病原真菌活性试验研究，综合筛选出2株广谱和选择性抗病原真菌较好的菌株，这为今后寻找抗病原真菌活性分子以及生物型农药的开发提供参考。