头孢曲松钠对小鼠肠道菌群组成及代谢的影响

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

抗生素对人们生活的影响日益得到重视，除了抗生素不合理使用造成的危害以外，环境中的抗生素、小剂量抗生素对人体健康的影响都是值得研究的问题[1-3]。肠道菌群是维系人体内微生态系统的重要组成部分，在正常情况下，肠道菌群与宿主共同维持微生态平衡，保护人体的健康。当受到外界因素如饮食状况、心理压力、抗生素等影响时，肠道菌的种类和数量会发生一系列变化。目前，肠道菌群失调已被证明与多种疾病有关，如难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、癌症和2型糖尿病等[4-6]。抗生素能够显著改变肠道微生物菌群结构，从而影响微生物的代谢和肠道健康。有研究表明：抗生素会影响小鼠体内的代谢平衡[7]，多黏菌素E灌胃能够诱导肠道菌群失调，且导致肠屏障功能损伤和细菌易位[8]。同时,抗生素处理使小鼠肠道肠球菌增殖，改变了相关的肠道菌黏液层，降低了肠壁厚度[9]。

为了进一步揭示抗生素对肠道菌群组成的影响及其作用机制，笔者拟采用经典的头孢曲松钠造成抗生素相关性菌群失调模型，研究抗生素对肠道菌群组成及相关代谢的影响，为抗生素对机体代谢的影响研究提供参考，以期为评价抗生素对机体的副作用及抗生素用后的修复等提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

20 只SPF级 BALB/c小鼠，雌雄各半，体重(18±2) g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，寄养于浙江工业大学实验动物中心动物房内，小鼠饲料营养成分如表1所示；头孢曲松钠购自山东润泽制药有限公司；乙酸、丙酸、丁酸和戊酸均购自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。

表1 小鼠饲料营养成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 动物分组与处理

20 只BALB/c小鼠，按随机原则进行分组，CK组雌、雄鼠各5 只，模型组(抗生素组)雌、雄鼠各5 只。参照文献[10]， CK组小鼠自由饮用无菌水，自由摄取食物。模型组小鼠灌胃 125 mg/mL 的头孢曲松钠溶液 0.2 mL/次(相当于成人正常剂量的10倍)，每天2次，时间间隔 6 h，连续灌胃6 d。在0 d和6 d收集小鼠新鲜粪便，- 20 ℃ 保存备用。采用高通量测序测定肠道菌群组成，分析抗生素所致小鼠肠道菌群组成的影响。小鼠处死前禁食 6～8 h，眼球取血，脱颈椎处死。血液4 000 r/min，离心10 min，取出上清血清，-20 ℃ 保存。

1.3 DNA提取

每只小鼠收集300 mg的粪便样品，然后同组样品混合起来，共有4个混合样品用于DNA提取。即对照组(CK组)和头孢曲松钠组(CRO组)分别在0 d(CK1和CRO1)和6 d(CK2和CRO2)收集的小鼠粪便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒从粪便中提取混合宏基因组DNA。

1.4 高通量测序和生物学分析

首先将提取得到的肠道DNA进行PCR扩增和纯化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1︰1的等量混合后测序。

1.4.1 原始序列数据

Illumina MiseqTM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，其中包含测序序列的序列信息以及其对应的测序质量信息。

1.4.2 数据预处理

Miseq测序序列中含有barcode序列，以及测序时加入的引物和接头序列。首先需要去除引物接头序列，将成对的序列拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据。

1.4.3 去除嵌合体及非特异性扩增序列

在PCR反应过程中，会由于延伸不完全产生一些嵌合体。同时也会产生一些非特异性扩增序列。为了保证信息分析质量，必须对其进行剔除。使用Usearch去除预处理后序列中非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用uchime进行鉴定嵌合体。随后，再将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行blastn比对，低于阈值的比对结果认为是靶区域外序列，并剔除掉该部分序列。

1.4.4 肠道菌群组成的生物学分析

众多序列按其序列间的距离进行聚类，然后根据序列与序列间的相似性当作域值分为操作分类单元(OTU)，一般域值的序列相似性设定为 0.97，则被认为可能属于属。对处理后序列进行物种分类，采用的软件为 RDP classifier，RDP classifier是基于 Bergey’s taxonomy，采用 Naive Bayesian assignment 算法对每条序列在genus 水平上计算其分配到此 rank 中的概率值，一般概率值大于 08，即 RDP 分类阈值，则说明此分类结果可信(测序片段长度<250 时可适当调低此值到 0.5，如只测 V3，V6，V4 区)。Bergey’s taxonomy分为6层，它们依次为域 (domain)、门 (phylum)、纲 (class)、目 (order) 、科 (family)和属 (genus)。本实验主要在门纲目科属水平上进行优势菌群的分析，探索抗生素对小鼠肠道菌群组成的影响。

1.5 小鼠粪便中短链脂肪酸的测定

取100 mg粪便样品置于10 mL离心管中，加入1.6 mL去离子水溶解，涡旋振荡2 min钟，加入 0.4 mL的硫酸(50%硫酸溶液)和 1.5 mL乙醚，250 r/min的摇床中摇晃 45 min，然后 3 000 r/min离心5 min。取上清液于干净的试管中，加入无水氯化钙脱水，过0.22 μm滤膜，乙醚定容至1 mL进样安捷伦气相色谱检测。

色谱条件：色谱柱为菲罗门 ZB-FFAP；程序升温100 ℃保留 2 min，8 ℃升到 240 ℃保持 10 min后运行 230 ℃ 10 min；进样口为250 ℃；FID为350 ℃；以N2为载气，流速为1.69 mL/min。

1.6 小鼠血清中脂多糖的测定

采用小鼠(Mouse) 脂多糖ELISA检测试剂盒，操作如下：1) 从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃；2) 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；3) 样本孔先加待测样品20 μL，再加样本稀释液30 μL；空白孔不加；4) 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min；5) 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；6) 每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.7 统计学处理

两组之间的差异用t检验进行分析。两组以上的数据采用单因素方差进行分析。

2 结果与分析

2.1 头孢曲松钠灌胃对小鼠体重的影响

如图1所示，与CK组相比，抗生素灌胃后小鼠体重无显著性变化，体重增加在正常范围内。

图1 各组小鼠体重变化Fig.1 Weight changes of mice

2.2 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群组成的影响

头孢曲松钠对小鼠肠道菌群组成的影响如表2所示。

表2 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群组成的影响 1)Table 2 Effects of ceftriaxone sodium on intestinal flora in mice

注：1) CK为对照组；CRO为头孢曲松钠组；1为头孢曲松钠处理前；2为头孢曲松钠处理后。

2.2.1 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群门水平的影响

由表2可知：实验前后变化最大的是拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。CK组实验前后拟杆菌门的数量增加了12.68%，而头孢曲松钠组实验前后，拟杆菌门的数量减少了32%；头孢曲松钠组实验前后厚壁菌门丰度增加了25.43%，CK组实验前后厚壁菌门丰度降低了10.22%。头孢曲松钠对拟杆菌门和厚壁菌门的影响超出了CK组变化范围。

小鼠肠道菌群中主要的优势门为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，这三类细菌门的丰度值占总菌群数的97%以上。拟杆菌门可以消化复杂的碳水化合物，维持肠道正常生理，并且在免疫系统起着重要的作用[11]。与CK组相比，头孢曲松钠组灌胃后引起拟杆菌门减少。拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和拟杆菌属(Bacteroide)都属于拟杆菌门，且结果与拟杆菌门相似(表2)，表明头孢曲松钠灌胃能抑制益生菌(拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌科和拟杆菌属)生长。厚壁菌门被认为与肥胖、心血管疾病、糖尿病和慢性肠道炎症的发生有关，肥胖患者中厚壁菌门比例明显升高，而拟杆菌门比例明显下降[12]。与CK组相比，头孢曲松钠灌胃后导致小鼠厚壁菌门丰度明显升高，说明了抗生素能够造成肠道菌群紊乱。尹金宝研究发现，四环素暴露两周后，造成小鼠肠道微生物中拟杆菌门比例下降，厚壁菌门比例提高[13]，与本实验结果相一致，说明了抗生素对肠道菌群的影响可能存在相似性。

2.2.2 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群纲水平的影响

由表2可知：实验前后丰度变化最大的是拟杆菌纲(Bacteroidia)和梭菌纲(Clostridia)。头孢曲松钠组实验前后，拟杆菌纲的丰度降低了32.05%，CK组实验前后拟杆菌纲的丰度增加了12.67%；头孢曲松钠组实验前后梭菌纲丰度增加了21.05%，CK组实验前后梭菌纲丰度降低了11.89%。头孢曲松钠对拟杆菌纲和梭菌纲的影响超出了CK组变化范围。梭菌纲、梭菌目(Clostridiales)属于厚壁菌门，Kalia等研究发现，某些梭菌菌株会产生一些致命的毒素[14]，如艰难梭菌感染是导致抗生素相关性腹泻的最重要因素之一[15]，与CK组相比，头孢曲松钠灌胃后导致小鼠梭菌纲、梭菌目丰度升高，促进了致病菌的产生。

2.2.3 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群目水平的影响

由表2可知：实验前后影响最大的是梭菌目和拟杆菌目(Bacteroidales)。头孢曲松钠组实验前后，拟杆菌目降低了32.05%，CK组实验前后拟杆菌目的丰度增加了12.67%；头孢曲松钠组实验前后梭菌目丰度增加了21.04%，CK组实验前后梭菌目丰度降低了11.88%。头孢曲松钠对梭菌目和拟杆菌目的影响超出了CK组变化范围。

2.2.4 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群科水平的影响

由表2可知：实验前后拟杆菌科(Bacteroidaceae)变化明显。头孢曲松钠组实验前后拟杆菌科丰度降低了9.94%，CK组实验前后拟杆菌科丰度下降了0.36%。

2.2.5 头孢曲松钠对小鼠肠道菌群属水平的影响

在属水平上各样本菌群丰度值与细菌总数的比值见表2，其中实验前后拟杆菌属(Bacteroides)和unclassified变化明显。头孢曲松钠组实验前后拟杆菌属下降了9.94%，CK组实验前后下降了0.36%。头孢曲松钠组实验前后unclassified丰度增加了15.55%，CK组实验前后下降了2.5%。unclassified为未分类菌，其生理作用仍不清楚。

2.3 头孢曲松钠对小鼠粪便中短链脂肪酸质量分数的影响

短链脂肪酸是肠道微生物通过发酵过程产生的代谢产物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短链脂肪酸对哺乳动物能量代谢等各方面具有有益作用[16]。短链脂肪酸在结肠腔内不仅可作为肠黏膜细胞的主要能量来源，还可以减少促炎因子的生成，降低结肠炎症的发生。小鼠粪便中短链脂肪酸质量分数如图2所示。乙酸、丙酸、丁酸和戊酸质量分数在头孢曲松钠处理后比对照组显著降低，这表明抗生素灌胃后改变了肠道微生物菌群结构，导致有益代谢产物的降低，如短链脂肪酸。作为肠道菌群重要的有益代谢产物，短链脂肪酸已被证实与糖尿病等代谢性疾病密切相关，而抗生素造成的肠道菌群紊乱，也可能与多种代谢性疾病存在潜在的相关性。

图2 头孢曲松钠处理对小鼠粪便中短链脂肪酸质量分数的影响Fig.2 Effects of ceftriaxone treatment on the contents of SCFAs in mice feces

2.4 头孢曲松钠对小鼠血清中脂多糖浓度的影响

脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的一种物质[17]。它可能是导致小鼠代谢性内毒素血症、低度全身炎症和胰岛素抵抗的关键物质[18]。肠黏膜屏障是肠道的生物屏障，能阻止有害物质进入血液，两组小鼠血清中脂多糖浓度如图3所示。头孢曲松钠处理后，小鼠血清中脂多糖浓度显著高于对照组，说明抗生素处理对肠黏膜屏障造成了损伤。同时，头孢曲松钠灌胃引起的血清中脂多糖浓度增加，也会促进炎症及相关疾病的发生。

图3 头孢曲松钠处理对小鼠血清中脂多糖浓度的影响Fig.3 Effects of ceftriaxone treatment on the concentration of LPS in mice serum

3 结 论

抗生素使用或暴露可引起肠道菌群紊乱，探索抗生素作用下肠道菌群组成的改变将有利于相关机制研究的深入开展。本研究采用新一代高通量测序技术，通过检测头孢曲松钠灌胃前后小鼠肠道菌群组成的变化，发现头孢曲松钠会改变小鼠肠道菌群组成，造成肠道菌群紊乱，可导致小鼠肠道有害菌(梭菌纲、梭菌目)的丰度增加并抑制益生菌(拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌科和拟杆菌属)生长；而肠道菌群紊乱可导致短链脂肪酸质量分数下降及脂多糖浓度升高，促进炎症的发生。因此，在肠道菌群研究的基础上，进一步揭示抗生素对机体代谢的影响，探索抗生素相关性肠道菌群修复技术，都将是降低抗生素副作用的重要研究方向。