食用菌漆酶的提取与应用技术研究进展

任红艳，张瑞琴，张婷婷，张飞龙*，方炎明

（1.西安生漆涂料研究所，陕西 西安 710077；2.南京林业大学生命科学学院，江苏 南京 210037）

食用菌是可食用的大型真菌，具有较高的营养价值和药用价值，在分类上属于菌物界（Fungi）真菌门（Eumycota；Mycobionta），绝大多数属于担子菌亚门（Basidiomycotina），如平菇、香菇；少数属于子囊菌亚门（Ascomycotina），如羊肚菌。目前可人工栽培的食用菌种类有数十种[1]。食用菌在生长发育过程中分泌大量漆酶，对其本身的细胞分化、生长发育、子实体防御有重要意义，漆酶的存在能够缩短食用菌成长周期，降低生产成本，提高食用菌抗杂菌能力。

漆酶（EC 1.10.3.2） 是以铜离子为活性中心的含糖多酚氧化酶，归类于蓝色多铜氧化酶家族，能够催化酚类物质或者多酚类物质[2-5]形成对应的醌。1883年，日本科学家Yoshida[6]从漆树汁液中分离得到可以催化酚类反应的物质，1894年Bertrand G[7]成功将这种能够催干漆酚成膜的金属蛋白提取出来并命名为漆酶（laccase）。

漆酶作为生物蛋白酶，具有参与生物体应激防御反应、细胞壁重建以及腐殖质代谢等功能。食用菌漆酶是1种胞外酶，大量存在于食用菌培养基残渣中，因其优良的特性受到众多研究者的青睐。国内食用菌研究主要侧重于食用菌的栽培技术和菌种选育等方面，而对于生产后菌渣的开发和利用报道极少。食用菌栽培菌渣中含有大量的漆酶，充分利用漆酶可以提高食用菌利用率，降低生产成本，延长食用菌产业链，对食用菌产业持续发展、提质增效具有进步意义。

1 漆酶的主要来源

漆酶普遍存在于植物、微生物、动物等的器官或组织中，根据漆酶来源可以分为植物漆酶、微生物漆酶、动物漆酶等。植物漆酶主要来源于双子叶植物纲 （Dicotyledoneae） 无患子目 （Sapindales） 漆树科（Anacardiaceae） 的树种，如漆树、芒果树等，在植物愈伤组织形成和木质素合成过程起到重要作用[8]。微生物漆酶可细分为真菌漆酶和细菌漆酶，真菌漆酶主要来源于子囊菌纲（Ascomycetes）、担子菌纲 （Basidiomycetes） 和半知菌纲 （Deuteromycetes）等的真菌微生物，主要起降解木质素的作用[9]；细菌漆酶主要来源于球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）、固氮螺菌属（Azospirillum）、地中海海洋性单胞菌属[10-12]，细菌漆酶主要参与孢子色素合成与维持铜离子平衡过程[13]。

目前，实际应用于工业生产的主要是真菌漆酶，食用菌是真菌漆酶的主要来源之一。研究表明，漆酶与食用菌生长呈正相关[14]，通过筛选食用菌漆酶高产菌株、基因工程技术构建等，为漆酶应用于食品加工方面提供理论基础。1953年Freudenberg[15]对蘑菇挤出液展开研究，研究表明蘑菇中多酚氧化酶可能参与了蘑菇菌株的木质化过程。Marques de Souza[16]研究表明秀珍菇在菌丝生长时会向胞外分泌漆酶，漆酶参与菌丝体的发育过程。食用菌栽培时添加漆酶制剂，能有效抑制杂菌污染，漆酶还与真菌的色素形成有关，通过催化反应参与分生孢子色素合成。

2 漆酶提取技术

漆酶提取是指将漆酶从生物体中分离纯化的过程，一般会涉及到过滤、层析、电泳、等点聚焦等技术手段。漆树漆酶的提取主要通过以下途径：收集生漆→有机溶剂沉淀→收集不溶物→去杂质（溶解于磷酸盐缓冲液）→粗品漆酶提取（超滤）→漆酶纯化（盐析、透析、层析）→再纯化（等电聚焦、电泳等）→漆酶活性成分收集。

真菌漆酶多为糖蛋白，其分子量差异很大。部分菌株产生的漆酶由数种同工酶组成，但皆为糖蛋白与单体酶。多数真菌漆酶存在于真菌发酵液与食用菌培养基残渣中，过滤掉菌体即可提取，部分真菌漆酶是胞内酶，需先进行细胞破碎后再提取。真菌漆酶的获得主要通过以下途径：选取菌种→培养菌种→优化条件→菌种发酵→发酵液过滤 （弃菌体）→粗漆酶提取（盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等手段）→纯化漆酶（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析）→漆酶再纯化（电泳、等电聚焦）→漆酶活性成分收集。

食用菌漆酶的提取方法与以上方法类似，通过以下途径获得：食用菌菌渣收集→过滤分离（弃菌体）→粗漆酶提取（盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等手段）→纯化漆酶（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析）→漆酶再纯化（电泳、等电聚焦等方式）→漆酶活性成分收集。

食用菌漆酶与漆树漆酶的获得方式只在前期获得粗品的步骤存在区别，后期的精细纯化提取基本相同。试验表明，食用菌漆酶的提取与培养碳源、pH、表面活性剂和温度密切相关[17]。漆酶催化反应的适宜反应温度较低，T Saito[18]等从土壤中分离纯化得到真菌（毛壳菌科）胞外漆酶，经测试其氧化丁香醛嗪的最适pH为7.0，最适温度为42℃，漆酶在4℃下稳定288 h，25℃和40℃下半衰期分别为150 h和20 h。

3 漆酶的结构与活性

3.1 漆酶的结构

典型的漆酶大多由单一多肽组成，一般含有约500个～550个氨基酸，分子量约 60 kDa～70 kDa，并伴有不同程度的糖基化，其含糖量和种类因漆酶来源不同而存在差异。晶体研究表明，目前得到的所有真菌漆酶结构都呈杯蛋白构型，相对的分成三区，每区均具有β-圆桶状、螺旋、loop拓扑构型[19]。大多数漆酶有3个铜离子结合位点，结合有4个铜离子，分别是1个Ⅰ型或蓝型铜，顺磁性，氧化状态在614 nm左右有强吸收，1个Ⅱ型或通常型铜，顺磁性，无特征吸收，2个Ⅲ型或偶联的双核型铜，反磁性，氧化状态在330 nm左右有强吸收。Hukulinen等[20-21]对漆酶蛋白质晶体结构进行研究，发现4个铜离子位于漆酶蛋白的中央空穴，组成了具有特定三维构型的三核铜簇活性中心。

3.2 漆酶的活性

漆酶的活性通常指漆酶的催化氧化作用，漆酶的催化氧化机理非常复杂，漆酶的氧化还原电势大都在0.5 v～0.8 v，能够直接氧化酚型芳香族化合物和其他负电子化合物，将氧分子直接还原为水。反应机理如图1。首先Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+分别从底物处接受1个电子变为一价铜离子Cu+，然后发生分子内电子转移，将电子传递给Ⅲ型铜偶合离子对使它们从二价变为一价，而Ⅰ型和Ⅱ型铜离子又重新变为二价型铜离子，二价型铜离子可以再从底物分子接受电子而变成一价铜离子。当四个铜离子都为一价时漆酶处于还原态。在存在氧气条件下，还原态漆酶可被氧化然后脱水恢复到氧化态。这样漆酶通过四个铜离子的相互协同作用传递电子同时发生价态变化，从而实现对底物的催化氧化作用。

图1 漆酶对漆酚的催化氧化机理Fig.1 Mechanism of catalyzed oxidation of urushiol by laccase

漆酶是1种糖蛋白，极易因受到温度、pH、介质、电磁场和糖链等的影响而改变其空间结构，从而导致漆酶活性发生改变，漆酶活性受外界因素影响的原因还在探索中。大量研究者试图通过改变外界条件而提高漆酶的反应活性，比如改变反应介质、将漆酶固定化、增加反应底物官能团等方式。Hao Li等[22]研究了磷酸盐官能化碳点（PCD） 对漆酶催化活性的影响，表明漆酶/PCDS杂化材料能够有效提高漆酶的催化活性。Sijie Guo[23]研究了金纳米颗粒对漆酶可见光诱导催化反应活性的影响，表明纳米颗粒与酶之间的相互作用对于漆酶催化剂的分子设计有指导意义。

3.3 漆酶的活性测定

漆酶与多数酶一样能够与某些特定的物质（丁香醛连氮、愈创木酚、α-萘酚、焦性没食子酸等）在短时间内发生显色反应，因此一般通过分光光度法、微量热法、脉冲激光光声法等测定漆酶，其中有关分光光度法测定漆酶的报道较多，Suyan Qiu等[24]根据3-叠氮香豆素与云芝漆酶的相互作用，提出了漆酶的测定方法。Seyed[25]将愈创木酚衍生物（DDG）作为1种底物与漆酶发生反应，并开发了新型漆酶检测装置，通过利用分光光度法测定了粗壮神经孔菌漆酶的动力学参数，2-甲氧基-4- [（4-苯基）] 偶氮苯酚 （Km＝93.5 μm，v＝1.98 μm·min-1) 也被鉴定为能够准确和常规分光光度法测定漆酶的适宜底物。

4 漆酶的生物化学特性

漆酶具备多种生理生化功能，广泛参与植物的形态发生、与植物寄主相互作用、生物体应激防御反应以及木质素降解等过程。漆酶一般都有不同程度的糖基化，而糖基化可能对漆酶的分泌、活性、温度和pH等有重要影响。漆酶作为生物蛋白酶，具有参与生物体应激防御反应、细胞壁重建以及腐殖质代谢等功能。

4.1 参与菌株形态发生与发育

食用菌漆酶参与细胞壁形成，并在食用菌子实体的防御中发挥作用，漆酶还能够参与食用菌子实体的呼吸作用，促进子实体生长发育，菌株生长过程又能够生产漆酶，二者相互协调。

4.2 参与木质素的降解过程

木质素是多个单元通过稳定的醚键和碳碳键连接而成的多酚类三维网状高分子芳香族化合物，其结构复杂，且能够很好的抵御外界的侵扰与降解。真菌漆酶通过与其他微生物酶（过氧化物酶、锰过氧化物酶、木质素修饰酶等）共同作用，切断木质素高聚物之间的连接键，并将其侧链氧化，从而将木质素分解成小分子物质，被真菌或者细菌利用，达到降解木质素的目的[26]。

4.3 氧化化学制剂中氯酚类化合物与苯胺类取代物等

氯酚类化合物与苯胺类取代物被广泛用于染料、防腐剂、杀菌剂、杀虫剂和除草剂等的生产中，是目前水土污染的主要污染源之一，有强致毒性[27]。漆酶通过其本身的氧化还原作用能够与有机污染物发生催化氧化反应，将污染物转化过滤为大分子聚合物或者生成无毒无害的化合物，因此被广泛用于污水处理、环境治理等领域。

5 漆酶的应用技术

5.1 食品加工

漆酶在果汁澄清[28]、面粉烘焙[29-30]、葡萄酒酿造[31]、食用菌栽培等方面具有重要作用。饮料中的酚类化合物极易被氧化导致果汁浑浊、颜色深、口感差，漆酶能够氧化酚类化合物并与之发生聚合反应形成大分子物质，达到澄清果汁的目的[32]。目前面粉添加剂一直存在安全隐患，漆酶能够提高面粉的强度与稳定性，且有望取代传统的面粉改良剂[33]。Charlotte L[34]发现漆酶存在交联能力，能够诱导催化氧化生物蛋白，在食品等行业具有应用潜力。Struch等[35]研究表明，漆酶能够促使酸奶蛋白凝胶化，改善酸奶加工过程中机械搅拌对酸奶品质的影响。黄曲霉素多见于发霉的粮食、粮制品及其他霉腐的有机物上，其毒素的危害性在于对人和动物肝脏组织有破坏作用。王会娟等[36]采用培养基平板培养法和液体发酵法对平菇菌株产漆酶的能力进行比较分析，筛选得到高产漆酶的平菇菌株，表明漆酶在降解食品黄曲霉素方面效果明显。食用菌栽培过程中添加漆酶制剂可促进食用菌菌丝生长、原基形成，从而缩短生产周期、提高产量。

5.2 造纸工业

造纸行业难以解决的技术难题是木质素的脱除，木质素含量直接影响到纸浆质量和色泽，传统造纸行业一直使用氯漂法脱除木质素，但漂白过程会产生含有大量有机芳香族等有毒污染物的污水，对环境污染严重。而木质素高聚物在酶的作用下，结构单元连接键会断裂，侧链也会发生化学反应，从而分解成小分子物质。因此酶解法能够避免造纸过程的二次污染。

真菌漆酶属微生物降解酶体系，试验表明，多种酶共同作用会提高木质素的降解能力。Jan P[37]研究了漆酶降解木质素过程中的氧化还原电位变化，为木质素降解的研究提供了基本保障。

目前，研究者对漆酶及其介质系统的研究报道较多，Jie Jiang[38]将漆酶用于2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）/漆酶/O2体系，在不添加任何含氯氧化剂的情况下，将木质纤维素降解成纤维素纳米纤维（CNFs），有效降低了能耗，但其缺点是需要消耗大量的TEMPO和漆酶。Qiang Fu[39]研究了聚乙烯亚胺-TEMPO（PVAm-T） /漆酶复合物对木质素的降解反应，提出PVAm-T/漆酶的吸附结构与电化学性能直接影响木质素的降解能力。Haifeng Zhou[40]研究表明碱木质素在漆酶/木聚糖酶系统下能够被有效降解，木聚糖酶的加入可以提高漆酶的活性。Daniela Huber[41]考察了氧气和介质对漆酶催化木质素磺酸盐聚合的影响，表明外部氧气供应比漆酶介质的存在更有益于木质素的降解反应。张鹏飞等[42]发现细菌漆酶对木质素表现出较强的降解作用，并且细菌漆酶降解能力高于枯草芽孢杆菌。

5.3 染整

染整是指对纺织材料（纤维、纱线和织物）进行以化学处理为主的工艺过程，现代也通称为印染。染整同纺纱、机织或针织生产一起，形成纺织物生产的全过程。染整包括预处理、染色、印花和整理。染整质量的优劣对纺织品的使用价值有重要的影响。传统的染整工艺需要耗用大量化学物质，污染严重。酶染整工艺是采用生物酶进行染整加工的环境友好型的染色工艺，具有效率高、反应条件温和、操作安全、无毒害污染等优点。多项研究表明[43-44]，生物氧化还原酶能够被用于染整工业，采用漆酶和纤维素酶对牛仔布进行同浴酶洗整理，可使织料表面光洁，而处理液基本保持无色[45]。郑小静等[46]采用纤维素酶和漆酶对木棉纤维进行预处理，结果表明经过漆酶处理后，木棉纤维微观结构变小，热解温度降低约10℃，吸水率较未处理前增加25%左右，靛蓝染色K/S值在6以上，染色效率得到有效提高。

5.4 生物转化

酶氧化反应具有反应条件温和、反应底物广泛、催化专一、不会对环境产生危害等特点，与传统氧化反应相比，在有机物合成方面的应用潜力巨大。芳香族和稠环化合物多为化学合成工艺中的前体物质，而漆酶能够利用氧分子为电子受体，氧化含酚羟基的芳香族化合物。

Kengo Akagawa[47]研究表明，漆酶作为助催化剂，在特定反应条件下，与肽一起催化不对称R-氧氨化反应，得到产物醛或者羧酸，其可以取代传统金属催化剂，与有机物体系的扩展也会有助于绿色化学的发展。Junhe Lu[48]研究了漆酶在催化氧化盐酚（XPs）过程的动力学过程，解释了部分多卤产品在环境媒体中的起源。Linson Lonappan[49]研究了农产漆酶降解双氯芬酸的动力学过程及其转化产物。漆酶氧化产物单一，来源广泛，成本较低，易分离纯化，且具有环境友好性，因此漆酶氧化技术在有机合成方面应用前景广阔。

5.5 生物电化学

生物传感器（biosensor）主要用于分析检测，具有专一性强、分析速度快、准确度高等优点。漆酶是制备生物传感器的优良材料，采用漆酶的传感器灵敏度高，专一性强，能够广泛应用于医疗、环境等在线检测等领域。

Leite[50]利用漆酶和过氧化物酶制备了具有协同效应的双酶生物传感器，可用于在线检测儿茶酚胺。近年来，漆酶用于生物电极的报道越来越多，Tao Wang[51]采用漆酶替代金属催化剂制成漆酶生物电极（DET），用于亚砷酸盐/砷酸盐生物传感器，灵敏度为（0.91±0.07） mV·mm-1，可用于地下水中无机砷、砷酸盐和亚砷酸盐等污染物的监测。

生物燃料电池是指利用酶或者微生物组织作为催化剂，将燃料的化学能转化为电能的发电装置。研究表明，采用漆酶的生物燃料电池效果明显，Qin Qian[52]将漆酶用于酶促生物燃料电池中，考察了离子液体对生物电极相容性的影响。Theodore Lazarides[53]首次利用卟啉敏化漆酶体系的四电子还原作用，在光驱动下将氧分子还原成水，使有氧光驱动转换的想法变得合理。漆酶也因其优良的特性在生物系统中应用前景广阔。

5.6 污水处理

工业氯酚类废水、纸浆和造纸工业废水、染料和印刷废水、城市废水、受污染的土壤等对生态环境造成极大的危害，污水处理问题已成为生态环境保护中急需解决的问题。工业污水中含有大量的有机污染物，比如腐殖质、类脂化合物、含氮有机物、烃类化合物等，采用传统污水处理方法见效慢、成本高，易产生二次污染，不适合大规模应用，而漆酶能够通过其本身的氧化还原作用有效降解有机污染物，在污水处理方面应用广泛。

Jinyuan Hu[54]提供了漆酶在氧气存在条件下将As（III） 氧化成As（V） 的数据，并解释了漆酶在反应中失活的原因，为酶解法的优化和治理砷污染的潜在发展提供了基础。Qi Luo[55-56]成功利用漆酶诱导催化反应降解全氟辛烷磺酸，该反应是以1-羟基苯甲酸三唑（HBT）为介质的氧化腐殖化反应，为降解全氟辛烷磺酸污染提供了潜在途径。Rupam Sarma[57]研究了层状自组装漆酶反应膜对氯代有机物的降解反应，表明功能化膜与漆酶结合能够极大提高漆酶对氯代有机物的降解效率。

偶氮类染料具有致癌作用，偶氮类染料污水处理一直是个技术难题。刘文华等[58]优化了毛栓菌产漆酶的条件，并考察了毛栓菌酶对于偶氮染料AR1和RB5的降解能力，越来越多的研究表明漆酶用于污水处理具有有效性和可行性。

6 结语

6.1 食用菌副产物开发利用技术研究极具前景

食用菌产业作为一项投资小、周期短、见效快，符合人们消费增长和农业可持续发展的需要。近年来，食用菌的栽培技术、食用价值和药用价值研究受到广泛关注，而食用菌培养副产物开发利用技术研究较少，大量的食用菌栽培菌渣被废弃，造成极大浪费，因此食用菌菌渣漆酶提取技术有待进一步的开发和利用。

6.2 漆酶应用技术研究大有发展

人们利用蛋白质分离提取技术从食用菌培养基中获到漆酶，并通过光谱学、动力学和晶体学等方法，进一步了解漆酶结构和催化机制。近年来，漆酶在多个领域的应用技术也被广泛研究，但仍然存在诸多问题：

目前漆酶催化活性研究取得了重要进展，漆酶在木质素降解、废水处理、生物转化等方面潜力巨大，漆酶的应用为人类开发利用食用菌副产物提供了全新的途径。然而，由于漆酶生物催化的分子机理和调控技术还需要全面分析和进一步的明确、验证，因此漆酶的应用研究尚处于实验室阶段，要实现工业化应用还需不断努力。这也是漆酶实用技术研究的世界难题和创新研究的焦点。

尽管漆酶具有反应底物广泛，反应条件温和的特点，但在强酸强碱或者高温等环境中易失活，影响了漆酶的实际应用。因此，需要通过高通量筛选具有高活性、高稳定性的产漆酶菌株，以提高漆酶不同环境下的存在能力。

食用菌漆酶工业化应用研究与食用菌副产物价值的开发需要被业界关注，这是科学工作者面临的令人振奋的挑战。