向海地区斑嘴鸭体内1新种绦虫的分离与鉴定1)

侯志军 王丽新 沈美英 柴洪亮 杨思远

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (黑龙江民族职业学院)

斑嘴鸭(Anaspoecilorhyncha)在向海地区很普遍且分布很广[1]，隶属鸟纲、雁形目、鸭科、鸭属，中型游禽[2]。在我国东北部、北部及华北等地区繁殖，在我国长江中下游、东南沿海和台湾越冬。由于过度猎取和环境恶化，斑嘴鸭数量日趋减少，因此被列入《世界自然保护联盟》。

绦虫隶属于扁形动物门的绦虫纲。绦虫种类众多，生物学特性各异，分布广泛，对人和动物危害严重。鸟类[3],特别是水禽，可以寄生多种绦虫[4]，引起严重的鸟类疾病。寄生于鸟类肠道内的绦虫会争夺宿主营养，或钻入宿主肠黏膜破坏肠壁组织，或由多数虫体密集造成肠阻塞，阻碍宿主的消化吸收而影响鸟类的正常生长发育[5]，如戴文科的节片戴文绦虫(Davaineaproglottina)、膜壳科的毛形剑带绦虫(Drepanidotacnialanceolata)、片形皱褶绦虫(Fimbriariafasciolaris)等[6]。

膜壳科(Hymenolepididae)绦虫在哺乳动物和鸟类中有着广泛的寄生，如鼠类、蝙蝠和水禽等。目前至少有620种绦虫和膜壳科的230种绦虫寄生在鸟和哺乳动物中。面对如此多种类的绦虫，对它们分类问题的研究从未停止过。近期，Khalil et al.对膜壳科进行了比较系统的修订[7]，但并没有对每一个属进行修正。膜壳科的绦虫种类繁多，部分种类形态学特征相似，如果仅仅依据形态学特征进行种属鉴定，由于缺乏明确形态学特征往往会导致物种分类鉴定的错误[8]。例如，在鸭小肠内分离出的1种膜壳科的绦虫(MonosaccanthesCzaplinski,1967),直到2001年才被发现是EchinatriumSpassky，1956的同物异种[9]。

核苷酸序列数据成功应用于寄生虫分类，这有助于系统解决膜壳科寄生虫分类面临的问题[10]。基于一个完整的形态特征评估的和系统发育的证据[11]，曾被列入啮壳属(Glires)一些物种已被转移到最近成立的Pararodentolepis属[12]。此外，Greiman et al.在结合了核酸序列(28S,nad1)和形态学数据的基础上创立了一个新属[13]。显然，膜壳科分类进一步的完善需要形态学和分子数据的结合使用[14]。

在中国雁形目绦虫的研究非常少，目前为止还未见斑嘴鸭体内膜壳科绦虫的研究。

1 材料与方法

样品材料：斑嘴鸭取自吉林省向海地区。绦虫取自斑嘴鸭小肠内，置于70%酒精内用于形态学和分子研究。

镜检方法：将经苏木素染色[15]的绦虫标本在光学显微镜下进行形态学观察。

DNA的提取：取5 g液氮中保存的虫体组织，置于研钵中，研磨粉碎，使用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，-20 ℃下保存。

PCR扩增3个基因所用引物：扩增28S rDNA使用的引物参考Hillis et al.[16]设计的，目的片段长度为1 100 bp。扩增nad1基因使用的引物参考Widmer et al.[17]设计的,目的片段长度为700 bp。扩增18S rDNA基因引物设计是通过NCBI数据库检索相关18S基因序列，自主设计,目的片段长度为500 bp。所有引物序列均委托库美生物有限公司合成。引物序列详细见表1。

表1 28S rDNA、nad1、18S rDNA基因扩增引物序列

PCR扩增3个基因所用反应体系及反应条件：PCR扩增采用25 μL PCR体系，PCR buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 2.5 μL，Primer1 1.0 μL，Primer2 1.0 μL，DNA 3.0 μL，蒸馏水12.0 μL，Taq酶1.0 μL。28S序列PCR反应程序为，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。nad1序列PCR反应程序为，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。18S序列PCR反应程序为，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。最后，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳下进行观察。

PCR产物测序及分析：用杭州博日科技有限公司的胶回收试剂盒纯化扩增产物，将纯化后产物连接到pMD18-T载体上，再将连接产物转化至感受态细胞中，振荡培养后涂布在含Amp的LB上，过夜培养后挑选白色的单菌落，对菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆并经凝胶纯化后送至库美生物有限公司进行双向测序。用序列分析软件对测序结果进行排列校对，然后与GenBank数据库中的已知序列进行Blast比对，确定虫种。

系统进化分析：用软件Mega 5(http://www.megasoftware.net/)中Neighbor-Joining(NJ)法构建基于3个基因位点(28S rRNA、nad1和18S rRNA)序列的系统树，并用Kimura two-parameter模型计算遗传距离；设置1 000次bootstrap检测支持度。

2 结果与分析

2.1 形态描述

中型绦虫，虫体全长93.0 mm，体最大宽度1.4 mm。前端细小，后端渐大，节片数目多，具缘膜，所有节片均长远大于宽。头节圆形，两侧略膨大，宽度为0.391～0.412 mm，平均为0.402 mm(图1A)。吸盘4个，具棘刺，呈圆形或椭圆形，大小为(0.098～0.103)mm×(0.101～0.144)mm，平均为0.101 mm×0.122 mm。顶端有顶突，平均大小为0.171 mm×0.131 mm，其周围有一圈小钩，共10个，呈“y”字形，吻钩长0.019～0.029 mm(图1B)。

颈节与头节清楚地分开，节片宽为头节的一半，宽度为0.236～0.337 mm，平均为0.286 mm。

未成熟节片细小，其内生殖器官尚未发育成熟。

成熟节片大小为(0.901～1.208)mm×(0.079～0.127)mm，平均为1.055 mm×0.103 mm。内含成熟生殖器官一套(图1C，D)。生殖器官为单套。生殖孔开口于虫体右侧，在每个体节侧缘前端1/3处。

睾丸2枚，成熟的睾丸呈椭圆形，直线排列于节片中央，紧凑并位于中间，与卵巢常有部分重叠。大小为(0.056～0.081)mm×(0.078～0.126)mm，平均为0.069 mm×0.102 mm(图1C)。具有外贮精囊，囊状呈椭圆形，一般位于排泄管附近，与阴茎囊相连接。平均大小0.102 mm×0.045 mm(图1C,D)。内贮精囊呈长梭形，占据阴茎囊的大部分，与阴茎囊几乎等长(图1C，D)。在成熟节片内，阴茎囊伸长但未到达节片中央，也并未穿过背渗透调节管，大小为(0.175～0.190)mm×(0.048～0.054)mm，平均为0.183 mm×0.051 mm(图1C,D)。

卵巢囊状位于中间，呈三叶，宽度为0.290～0.396 mm，平均为0.343 mm(图1D)。卵黄腺圆形或椭圆形，紧凑并位于中间，背对卵巢，大小为(0.071～0.096)mm×(0.056～0.095)mm，平均为0.084 mm×0.076 mm(图1D)。

孕卵节片(1.249～1.374)mm×(0.121～0.136)mm，平均为1.312 mm×0.128 mm(图1E)。背排泄管比腹排泄管细，腹排泄管直径0.029～0.045 mm，平均为0.037 mm。背渗透压管直径0.027～0.033 mm，平均0.029 mm(图1C，E)。孕节子宫呈囊状，囊袋不裂解为卵袋。子宫壁向节片四周扩张,越出排泄管，充满整个孕节(图1E)。

综上，分离的绦虫为1新种，命名为Diorchispoecilorhynchamorbus, Zhijun Hou,2017。

词源，拉丁语，morbus=病，poecilorhyncha=宿主的拉丁名；指的是该种绦虫对斑嘴鸭致病。模式样本存放于东北林业大学寄生虫研究中心，NEFU-HY1901，头节及部分节片染色及固定在加拿大树脂中(1条)，NEFU-HY190P两条没有头节的样本染色及固定在加拿大树脂中(2条)。

A.头节；B.吻钩；C.雄性器官；D.雌性器官；E.孕节。

2.2 分子进化分析

2.2.1 28S rDNA进化树

Bayesian法构建的28S序列的进化树结果见图2。在Bayesian树中，所测绦虫基因序列与Gen-Bank数据库上的其他绦虫的28S序列建立系统进化树分析，假叶目绦虫(Paraechhinophallusjaponicas)作为外群，位于进化树最底部。其余样本另开一支，与外群距离远，表明其余样本不属于假叶目，而是圆叶目。在圆叶目大枝中，又大致可以将所检测样本归为较大的5个小枝，包括裸头科(Anoplocephalidae)、膜壳科(Hymenolepididae)、双壳科(Dilepididae)、戴文科(Davaineidae)和中绦科(Mesocestoididae)。本试验的绦虫归于膜壳科分枝中。

图2 Bayesian法构建的绦虫28S的系统进化树

2.2.2 线粒体nad1进化树

Bayesian法构建的nad1序列的进化树结果见图3。在Bayesian树中，所测绦虫基因序列与GenBank数据库上膜壳科中其他属绦虫的nad1序列建立系统进化树。遗传进化树分析结果表明，本试验的绦虫并未归于膜壳科中已有nad1序列的各属绦虫之中，而是同膜壳属、假裸头属、微棘属并列，单独分为1枝。从亲缘关系上看，与微棘属、假裸头属、膜壳属的遗传距离比较近。

2.2.318S rDNA基因的绦虫序列比对和遗传距离

根据18S rDNA测序返回结果，通过NCBI上数据库Blast程序进行同源对比，从GenBank查找并下载相近的9属11种膜壳科绦虫的18S基因序列(包括双睾属、绉缘属、膜壳属、微棘属、啮壳属、Wardoides属、Coronacanthus属、Diploposthe属、Staphylocystis属)，连同本试验获得的12个序列的18S rDNA基因遗传距离的关系见表2。由表2可见，Diorchispoecilorhynchamorbus与双睾属的D.brevis遗传距离最近，为0.01。

3 结论与讨论

结合绦虫典型的形态学特征，如节片有缘膜且宽大于长、睾丸数量少(2个)，生殖孔为单侧开口(右侧)，28S rDNA进化树可以确定本研究的绦虫为膜壳科绦虫。

在28 rDNA进化树中，D.poecilorhynchamorbus与Hymenolepissp.的亲源关系最近；在nad1进化树中，其同微棘属、假裸头属、膜壳属的遗传距离较近，但是微棘属和膜壳属绦虫的吸盘无刺且睾丸为3枚，假裸头属与膜壳属绦虫头节没有顶突或顶突退化，而本试验绦虫有2枚睾丸且顶突明显。18S rDNA分析表明其同双睾属的Diorchisbrevis亲缘关系(相似度大于99%)最近。

图3 Bayesian法构建的nad1的系统进化树

绦 虫1234567891011121 Diorchis brevis2 Fimbriaria sp.0.073 Hymenolepis nana1.071.064 Wardoides nyrocae1.101.070.035 Coronacanthus omissus1.071.060.010.036 Diploposthe laevis0.080.061.051.051.057 Microsomacanthus pachycephala1.061.040.020.040.021.038 Rodentolepis microstoma1.671.631.331.381.361.581.339 Staphylocystis furcata0.070.031.071.101.080.051.061.5710 Hymenolepididae0.070.041.051.061.050.051.031.610.0311 Hymenolepididae1.081.050.010.030.011.040.021.361.081.0412 D. poecilorhynchamorbus0.010.071.071.091.070.081.051.680.060.071.08

在膜壳科绦虫的形态学鉴定中，顶突及其棘刺、睾丸的数量等形态学特征是重要的依据[18]。本试验绦虫的头节上有具10个棘刺的可伸缩顶突以及每个节片具睾丸2个，符合双睾属的典型特征。综合形态学和分子进化特征，可确定该绦虫为膜壳科双睾属绦虫。

通过观察比较本试验的虫体,其基本特征与主要构造如阴茎囊的位置、阴茎囊的长度范围、睾丸位置形状等，同D.excentricusMayhew,1925相符。但是D.excentricus绦虫的棘突上的小钩长度为0.027～0.039 mm，而笔者描述的虫体上的小钩明显较小(0.019～0.029 mm)，所以确定本研究分离的绦虫为膜壳科双睾属1新种，命名为D.poecilorhynchamorbus，Zhijun Hou,2017。

膜壳科是绦虫中种的数量最多的科[19]，但该科绦虫的许多描述是不完整的，此外，膜壳科的分子数据也很少。本研究获得的试验数据，将补充到相关的数据库，为将来膜壳科绦虫更为科学的系统分类提供支持。