β-伴大豆球蛋白对幼鲤生长、血清生化及免疫指标的影响

郑 鑫， 殷海成*，李昕硕，黄 进，黄 巍

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

豆粕不仅蛋白质含量高，而且资源丰富、价格合理，常作为水产养殖动物饲料中替代鱼粉的蛋白源（Lin 等，2011；Elangovan 等，2000）。 然而，豆粕含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等多种抗营养因子，不仅妨碍水产养殖动物对饲料营养成分的消化与吸收，而且高比例添加会造成鱼的肠道过敏型损伤（Ringo等，2006）。其中，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是豆粕中主要的抗原蛋白，尤其是 β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）具有比大豆球蛋白更强的免疫原性（Ogawa等，1995），常诱导幼龄动物如稚鱼、幼鱼等肠道发生变态反应，引起机体免疫功能紊乱，造成肠道损伤（Zhang等，2013）。吴莉芳等（2008）通过对草鱼、鲤鱼和埃及胡子鲇幼鱼饲喂含大豆抗原蛋白饲料，发现大豆抗原蛋白会破坏三种食性不同鱼的肠道组织完整性，使肠绒毛脱落和肠上皮细胞分离，影响其生长和饲料利用率。同样，Zhang等（2013）证实了β-伴大豆球蛋白会导致幼建鲤肠道和肠上皮细胞氧化应激和过敏损伤。此外，血液系统作为鱼体免疫防御的第二道防线，可反映其属性和生理状态，与其代谢、营养与健康等密切相关（向枭等，2012）。关于大豆球蛋白对鲤幼鱼血液主要生化指标的影响已有报道（赖红娥等，2013）。但对于β-伴大豆球蛋白对“豫选黄河鲤”幼鱼血液生化指标的影响鲜见报道。本试验以“豫选黄河鲤”幼鱼（幼鲤）为研究对象，通过饲喂添加不同比例的β-伴大豆球蛋白全价饲料，探讨其对幼鲤生长、血清生化和免疫指标的影响，为合理利用豆粕/大豆蛋白源及解析β-伴大豆球蛋白的抗营养机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制备 以鱼粉和β-伴大豆球蛋白为蛋白源，鱼油和豆油为脂肪源，α-淀粉和糊精为糖源，并补充赖氨酸、蛋氨酸以及复合维生素和矿物质配制含 β-伴大豆球蛋白为 0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和 12.5%的 6组等氮 （粗蛋白质38.0%）等能（总能15.0 MJ/kg）的试验饲料。各原料组分经粉碎过筛（60目），按配方标准称重，加油、加水充分混合，用曲阜市圣鲁机械厂生产的SLKL-120B型制粒机加工成1.0 mm直径的颗粒饲料，于40℃下烘干6 h，4℃冰箱中保存备用。试验饲料组成及营养成分见表1。

1.2 试验鱼与养殖管理 试验用幼鲤为河南省水科院种鱼繁殖场繁育的第8代“豫选黄河鲤”幼鱼，经河南工大生物工程学院鱼类营养实验室内驯化2周 （驯化期用鱼粉配制的全价饲料进行饲喂）后，选取体重为（48.37±0.03）g 幼鲤 540 尾，随机分成6组，每组3个重复，每个重复30尾，分养于18个安有自动循环水的水族箱中，用表1饲料进行8周的养殖试验。每天2次 （9:00和17:00），按照体重的1.3%和1.7%投喂。试验用水为曝气的自来水，水温为（25±1）℃，溶氧和pH约为6.0 mg/L和 6.8。

1.3 样品采集与测定指标 8周养殖试验结束，对各组幼鲤禁食 24 h，用MS-222（0.03%）麻醉，称重和测体长（L），计算各组平均增重率（WGR）、饲料系数（FCR）、蛋白质效率（PER）和平均肥满度（CF）。各重复组随机选取幼鲤10尾，心脏取血。血液在4℃条件下，以3000 r/min离心25 min，分离血清，-20℃冰箱保存备用，用于测定血清生化及免疫指标。

1.3.1 血清生化指标检测 血清生化指标采用郑州大学一附院Cobas-Mira全自动生化分析仪（罗氏公司，瑞士）检测。其中，双缩脲法检测总蛋白（TP）量、溴甲酚绿法测白蛋白（ALB）量、速率法检测谷丙（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性、酶法检测甘油三酯（TG）和胆固醇（CHOL）量。其中，血清总蛋白（540 nm）或白蛋白（630 nm）/（g/L）＝测定管吸光度/标准管吸光度×蛋白标准液浓度（g/L）；谷丙（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性/（U/L）=△A/min×F （其中，△A/min为时间变化率，F 试剂因数）； 胆固醇浓度/（mmol/L）=ESA/EST×5.17（ESA、EST为620 nm处血清和标准液光密度）。

表1 饲料组成及营养水平（风干基础）

1.3.2 血清免疫指标检测 采用免疫试剂盒检测血清（南京建成生物工程研究所）溶菌酶含量、免疫球蛋白 M（IgM）、白介素 1α（IL-1α）、补体C3、碱性磷酸酶（AKP），具体操作严格按照试剂盒说明书进行。其中，速率散射比浊法检测血清补体C3量。运用补体C3抗原与C3抗体反应生成免疫复合物，免疫复合物有一定的浊度，其浊度与补体C3的量成正比，通过与同样方法处理校准液比较，可知血清补体C3含量。同样方法检测血清IgM和IL-1α含量。比色法检测碱性磷酸酶（AKP，U/mg）活性，1 个碱性磷酸酶活性单位定义为100 mL血清在37℃与底物作用15 min产生1 mg酚（Pipe等，1990）。溶菌酶活性测定参照Ellis（1990）的方法。一个溶菌酶活性单位定义为单位时间（min）内每毫克蛋白质使吸光值变化0.001 的酶量 （U/mg）。

1.4 数据处理

WGR/%=（Wt-W0）/W0×100；

FCR=饲料投喂量/Wt-W0；PER/%=（Wt-W0）/（饲料投喂量 × 饲料蛋白含量）×100；CF/（g/cm3）=Wt/L3×100。

式中：Wt、W0分别为试验末期和初期幼鲤的平均体质量，g；L 为体长，cm。

试验数据用“平均数±标准差”表示，数据用软件SPSS 17.0进行单因素方差分析 （One-way ANOVA），若组间差异显著再进行Duncan’s多重比较，差异水平用p＜0.05表示。

2 结果

2.1 β-伴大豆球蛋白对幼鲤生长和饲料效率的影响 由表2可知，随β-伴大豆球蛋白添加量增加，各组幼鲤的终末体重、增重率、蛋白质效率和肥满度显著降低，饲料系数显著增加 （p＜0.05）。其中，2.5%的β-伴大豆球蛋白组的上述指标与对照组差异不显著（P＞0.05）；当β-伴大豆球蛋白添加量等于5.0%时，幼鲤增重率和蛋白质效率对比对照组分别降低14.67%、13.09%，而饲料系数比对照组显著升高14.49%（p＜0.05）；12.5%β-伴大豆球蛋白组肥满度显著低于对照组7.93%（p＜0.05）。

表2 β-伴大豆球蛋白对幼鲤生长和饲料效率的影响

2.2 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清生化指标的影响 由表3可知，随β-伴大豆球蛋白添加量增加，幼鲤血清血糖先增后降，而甘油三酯、尿素氮、胆固醇、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性呈现升高的趋势，总蛋白呈现降低的趋势 （p＜0.05）。其中，β-伴大豆球蛋白添加量为5.0%和7.5%两组血糖显著高于对照组27.89%、23.22%（p＜0.05），添加量为12.5%组的甘油三酯、尿素氮和胆固醇分别显著高于对照组27.36%、29.51%、9.05%（p＜ 0.05）， 添加量为 10.0%和12.5%组的谷丙转氨酶分别显著高于对照组9.61%、14.98%，谷草转氨酶活性分别显著高于对照组 8.12%、10.05%（p＜ 0.05），添加量为10.0%和12.5%组的总蛋白分别显著低于对照组12.22%、13.52%（P ＜ 0.05）。当 β-伴大豆球蛋白添加量为5.0%、7.5%和12.5%时，幼鲤血清白蛋白分别显著低于对照组16.35%、11.66%、10.98%（p＜0.05），而添加量为2.5%和10.0%时血清白蛋白与对照组差异不显著（P＞0.05）。

表3 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清生化指标的影响

2.3 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清免疫指标的影响 由表4可知，随β-伴大豆球蛋白添加剂量增5.0%两组血清溶菌酶活性与对照组差异不显著（P＞0.05），添加量超过5.0%时则显著高于对照组（p＜0.05），以添加7.5%组最高，为24.11%。血清补体C3变化与溶菌酶活性相似，其中添加5.0%和7.5%组分别显著高于对照组20.84%、14.08%（p＜0.05），添加2.5%和10.0%组与对照组差异不显著（P＞0.05），但添加12.5%组显著低于对照组1.59%（p＜0.05）。对比对照组，血清免疫球蛋白和白介素-1α随β-伴大豆球蛋白添加量显著增加（p＜0.05），但添加2.5%组的免疫球蛋白、添加2.5%～5.0%组的白介素-1α与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。血清碱性磷酸酶活性在β-伴大豆球蛋白添加量为5.0%时比对照组显著升高40.48%，而添加量为7.5%和10%时又分别显著升高37.73%、27.30%（p＜0.05）， 其中添加 2.5%和12.5%组与对照组差异不显著（P＞0.05）。

表4 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清免疫指标的影响

3 讨论

3.1 β-伴大豆球蛋白对幼鲤生长和饲料效率的影响 大豆抗原蛋白一方面不仅可干扰人和动物肠道对营养成分的消化和吸收、引起机体新陈代谢紊乱和造成生理生化反应障碍，另一方面由于幼龄动物免疫系统发育不完善，因而常常造成幼龄动物过敏而导致经济损失。其中，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白是大豆抗原蛋白的主要组分，尤其是免疫原性极强的β-伴大豆球蛋白常常诱导幼龄动物过敏反应 （Ostaszewska等，2005）。Zhao等（2010）研究证实4%的β-伴大豆球蛋白对仔猪十二指肠肠上皮细胞形态结构、增殖与凋亡产生影响，使肠上皮细胞形态结构发生改变、凋亡增加。Zhang等（2013）通过体内外试验研究β-伴大豆球蛋白诱导幼建鲤肠道上皮细胞，结果也证实β-伴大豆球蛋白可引起幼建鲤肠道炎症和肠上皮细胞氧化损伤，导致其肠道对营养物质消化吸收功能障碍并降低其生长性能。除此之外，鱼类摄入高剂量β-伴大豆球蛋白能够引起消化酶活性降低，导致鱼的消化机能下降，从而降低鱼的生长性能和对饲料营养物质的利用。孙玲（2008）报道，不同食性鱼类摄食大豆抗原蛋白可使消化酶活性降低。本研究中，添加5.0%的β-伴大豆球蛋白，其增重率、蛋白质效率显著降低，而饲料系数显著增加（p＜0.05）。这可能是幼鲤消化道发育不全，消化酶分泌不足，使β-伴大豆球蛋白滞留消化道，造成应激反应，诱导幼鲤鱼黏膜过敏性损伤。吴莉芳等（2011）利用60.0 mg/g的大豆球蛋白和40.0 mg/g的β-伴大豆球蛋白连续饲喂鲤、埃及胡子鲇和草鱼6周，结果发现，三种鱼的肠道完整性呈现不同程度的损伤，生长性能下降。同样，Rumsey等（1994）利用 34.4 mg/g的 β-伴大豆球蛋白使虹鳟肠道的完整性破坏和生长能力下降。

3.2 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清生化指标的影响 血液生化指标与其代谢密切相关，常用于反映动物的健康与生理状况。谷草/谷丙转氨酶是动物肝细胞合成的两种重要转氨酶，可参与调节动物机体蛋白质合成与代谢，而尿素氮是蛋白质代谢产生的主要终末产物之一，正常生理条件下，血清谷草/谷丙转氨酶和尿素氮的含量较低。研究证实，肝细胞受到应激或受损，会导致转氨酶从肝细胞进入血液，使血清中的含量升高，因此，其含量是反映肝细胞损伤的重要标志 （Strange等，1977）；而尿素氮在血清中的含量较低，表明蛋白质合成增强。在本试验中，添加小于等于7.5%β-伴大豆球蛋白的各组幼鲤血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性与对照组差异不显著（P＞0.05），但略有升高，表明适量β-伴大豆球蛋白对幼鲤肝脏未造成显著损伤，而添加10.0%和12.5%时，谷草和谷丙转氨酶显著升高，表示肝细胞膜通透性增加；添加小于等于10.0%β-伴大豆球蛋白各组，幼鲤甘油三酯、尿素氮和胆固醇与对照组差异不显著（P＞0.05），但略有增加，提示幼鲤肝细胞蛋白合成能力未受到严重影响，而添加12.5%时显著增加（p＜0.05），表明肝细胞受损。因为鱼血清中70%～80%胆固醇源于肝细胞，一旦肝细胞损伤，则血清胆固醇含量升高；甘油三酯含量高低可反映动物机体脂肪代谢水平，血清甘油三酯含量的增加，预示肝损伤，这一结果与Ma等（2005）结果类似。血清蛋白对于维持细胞营养、血液胶体渗透压和机体免疫功能起重要作用，可反映出肝细胞合成蛋白的能力 （Kaushik等，2004）。血糖作为机体的能量供给物质，其含量高低易受机体新陈代谢和环境因子的影响，生理条件下，血糖升高，则鱼的活动增强、摄食增加（Imsland等，2001）。本试验条件下，添加β-伴大豆球蛋白小于等于7.5%时，幼鲤血清中总蛋白与对照组无显著差异，而添加5.0%和7.5%β-伴大豆球蛋白两组幼鲤血糖含量显著高于对照组，相反白蛋白显著低于对照组（p＜0.05），表明幼鲤为满足蛋白合成，能量供求增加，相应地使机体免疫力降低。

3.3 β-伴大豆球蛋白对幼鲤血清免疫指标的影响 鱼类和其他脊椎动物一样，其血清中含有多种非特异性和特异性免疫因子，如溶菌酶、碱性磷酸酶、白介素、补体C3和免疫球蛋白等，检测血清不同免疫指标能体现其机体免疫应答水平（Keller等，1990）。溶菌酶作为其非特异性免疫因子之一，其活力的变化可反映非特异性免疫防御状态。本试验中，2.5%和5.0%β-伴大豆球蛋白添加量对幼鲤血清溶菌酶活力影响不显著，当添加7.5%及更高的β-伴大豆球蛋白，血清溶菌酶活力显著升高（p＜0.05），说明β-伴大豆球蛋白可激活幼鲤血清非特异性免疫应答。Kogdahl等（2000）用含豆粕的日粮饲喂大西洋鲑3周后发现，中、后肠溶菌酶活力显著高于对照组，说明大豆蛋白源能激活鱼类的非特异性免疫系统。碱性磷酸酶是与骨细胞代谢密切相关的代谢调控酶，其可参与磷酸基团、钙和磷的代谢等活动，因此，在营养物质的吸收与利用中发挥作用。研究证实碱性磷酸酶活力的升高是肝病发生的信号源之一（Giannini等，2005）。 本试验中，添加5.0%～10.0%的β-伴大豆球蛋白，幼鲤血清碱性磷酸酶显著高于对照组，说明幼鲤代谢活性增强，同时也预示肝细胞膜通透性增加或损伤。然而，Tibaldia等（2006）利用25%的豆粕替代饲料中18.67%的鱼粉研究欧洲鲈鱼发现肠道碱性磷酸酶活力降低了16.27%。关于大豆蛋白可引起幼鲤血清碱性磷酸酶变化差异还需进一步研究。巨噬细胞能分泌白介素、补体C3等多种免疫因子参与机体免疫。张锦秀等（2008）研究分离大豆蛋白对幼建鲤肠道健康的影响发现，幼建鲤的前、后肠出现顶端细胞脱落、固有层增厚且白细胞增加等病理症状，激活肠道特异性和非特异性免疫应答。邹文超等（2014）在斜带石斑鱼饲料中用豆粕替代鱼粉观察其血清溶菌酶、补体C3和IgM水平发现各替代组均高于对照组。本试验中，添加大于等于5.0%β-伴大豆球蛋白组幼鲤血清免疫球蛋白M、添加大于等于7.5%组白介素-1α和添加5.0%、7.5%组的血清补体C3均显著高于对照组，提示添加5.0%及更多的β-伴大豆球蛋白能激活幼鲤免疫系统，增加促炎性细胞因子水平。然而，研究发现高剂量添加大豆蛋白在鱼类饲料中，能抑制鱼的非特异性免疫。Burrells等（1999）用低于50%的豆粕饲料饲喂虹鳟，发现对免疫状态没有显著影响，但用含70%的去皮豆粕饲料时，则明显出现抑制，这一结果与张锦秀等（2007）研究高剂量添加去皮大豆饲喂幼建鲤相似。由于目前关于大豆蛋白对鱼的免疫报道很少，其差异的原因有待进一步试验验证。

4 结论

饲料中添加2.5%的β-伴大豆球蛋白不影响幼鲤生长、血清生化和免疫指标，添加5.0%或更高剂量则降低其生长性能，影响白蛋白、免疫球蛋白M、补体C3和碱性磷酸酶等血清生化指标，故幼鲤饲料中以添加2.5%的β-伴大豆球蛋白为宜。