热化学处理对玉米秸秆降解及糖化效果的影响

王 平， 常 娟， 刘超齐， 尹清强*， 黄玮玮， 王 涛， 党晓伟， 卢富山

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453000；3.河南普爱饲料股份有限公司，河南周口466000）

秸秆木质纤维素作为结构性碳水化合物是自然界存在的数量巨大的可再生资源，富含丰富的纤维素和半纤维素（Ravindran等，2016）。然而，因缺乏有效的处理方法，大部分秸秆资源都作为废弃物被焚烧或埋置于农田。秸秆中的纤维素和半纤维素可以通过微生物发酵和酶解转化成葡萄糖单体、乙醇、糠醛、动物饲料、能量和其他化学原料（Zu等，2014；Gregg等 1996）。 但是木质素复杂的高分子网状芳香类聚合物可阻碍纤维素酶接近纤维素聚合物，因此，怎样去分解木质素以提高纤维素聚合物糖化效率至关重要。

目前，“人畜争粮”矛盾日益激烈，特别是在世界人口迅速增长的今天，如何解决这个矛盾变得越来越重要。将秸秆中结构性碳水化合物转变成葡萄糖替代动物饲料中的能量原料是可行的。Guo 等（2013）和 Chang 等（2012）报道，玉米秸秆通过物理处理和微生物发酵可以转变成动物饲料，这将有助于解决畜牧生产中饲料短缺问题。

关于木质素裂解和提高秸秆实用性的方法很多，比如酸、碱、蒸汽爆破和有机溶剂处理已经用于秸秆以提高酶解效率 （寇巍等，2010；王堃等，2006；Saha等，2005；张利等 2001；Yoon 等，1995）。通常高浓度化学处理（强酸、强碱）效果优于低浓化学处理（弱酸、弱碱）（Han 等，2012）。 但是秸秆作为动物饲料开发，高浓度化学处理不仅会损害动物的健康，还因需要大量的水冲洗处理产物，造成环境污染和成本增加。研究表明，酸和碱处理秸秆生产乙醇取得显著成就，但是因化学离子（Na+，Ca2+和Cl-）超出动物营养标准不适用于饲料生产。二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和1,3-二甲基-2-咪唑烷酮等有机溶剂作为共溶剂来处理秸秆（Mai等，2014），但是这些处理造成有毒有害化学物质加入对动物健康有害。

为了避免上述处理方法中存在的弊端，本研究根据各种木质纤维素原料预处理方法和NRC（1994）动物营养标准及单胃动物生长特性，选择氧化钙、氢氧化钠、双氧水及氨水作为化学试剂。因为Ca2+和Na+是动物必需的矿物元素，动物营养标准中关于家禽对Ca2+和Na+需求分别为0.8%～2.0%和0.12～0.2%，所以选择低浓度石灰、2%（m/m）氢氧化钠来处理玉米秸秆。化学处理秸秆中残留的Ca2+和Na+可以被动物吸收，以减少饲粮配方中石粉和食盐的添加。 双氧水作为强氧化剂，遇热分解成水和氧气，作为秸秆饲料处理具有绿色和无残留特点。双氧水浓度的选择，从安全的角度考虑，选择低浓度作为本研究的添加量。氨水作为弱碱性试剂，其残留的少量氮对动物无毒无害，可以被肠道微生物利用。

根据木质纤维素各组分特点，选择易于生产的低温热处理方法来降解木质纤维素。因为高温处理（＞100°C）生产成本高，对设备要求严格，而且部分纤维素和半纤维素分解成还原糖，会进一步转化成糠醛、甲酸和丙酸等副产物，不仅影响动物健康，还对酶解产生抑制作用，所以本研究选择处理温度 ＜100°C。

本试验在低温、低浓度下，研究石灰+氢氧化钠、氨水和双氧水单独处理及复合化学低温处理方法对玉米秸秆降解的影响，通过对不同预处理玉米秸秆中木质纤维素含量及酶解后还原糖的测定，筛选出最佳的处理组合，为玉米秸秆饲料化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 玉米秸秆取自河南省原阳县郊区，挑选干净秸秆去根，自然风干。经锤片式粉碎机粉碎，过筛1 mm，室温保存。 纤维素酶和木聚糖酶市购。根据美国可再生能源实验室（NREL）纤维素酶测定方法（IUPAC，1987）测定纤维素酶活和木聚糖酶活。纤维素酶中包括纤维素酶（323 FPU/g）和木聚糖酶（500 U/g），其蛋白质含量为142 mg/g；木聚糖酶中的酶活力为5000 U/g，其蛋白质含量为6 mg/g；酶蛋白含量的测定采用Bradford（1976）方法。

1.2 试验设计

1.2.1 化学-热解秸秆 采用四因素四水平正交试验设计，分别以 2%（m/m）NaOH+CaO浓度（6%、9%、12%、15%）、 处 理 温 度 （60、70、80、90℃）、处理时间（3、6、9、12 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）；氨水浓度（0%、5%、10%、15%）、处理温度（20、40、60、80 ℃）、处理时间（6、12、18、24 h）、液固比 （7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）； 双氧水浓度 （2%、3%、4%、5%）、处理温度（50、60、70、80 ℃）、处理时间（2、4、6、8 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）进行化学热处理，每个处理3个重复，正交试验设计分别见表 1、2、3。

不同石灰浓度是取上清液，制备如下：每组处理风干秸秆样品重15.0 g，按照秸秆重的百分数计，取6% ～15%石灰（m/m），溶于按照不同液固比（水∶秸秆）所取的水中，搅拌5 min，静止10 min，取上清液。

表1 CaO+2%NaOH正交试验因素

表2 氨水正交试验因素

表3 双氧水正交试验因素

1.2.2 单一和复合化学处理秸秆 本试验是在正交试验最佳处理条件基础上进行。试验设计分组如下：

1组：未处理秸秆；2组：氨水；3组：2%NaOH+CaO；4组：双氧水；5组：氨水+双氧水；6组：2%NaOH+CaO+双氧水；7组：氨水+2%NaOH+CaO+双氧水；8 组：2%NaOH+CaO+氨水+双氧水；9组：氨水+双氧水+2%NaOH+CaO；10组 ：2%NaOH+CaO+双 氧水+氨 水 ；11 组 ：2%NaOH+CaO+双氧水+氨水+双氧水；12组：2%NaOH+CaO+氨水 （同时加入）+双氧水；13组：2%NaOH+CaO+氨水+双氧水 （同时加入）；14组：2%NaOH+CaO+氨水。复合处理中液固比均以第一个处理试剂液固比为准。

1.2.3 纤维素酶和木聚糖酶酶解预处理秸秆 酶解处理是以5%（m/V）秸秆加到蒸馏水中，酶负荷量为纤维素酶32.3 FPU/g秸秆（相当于14.2 mg蛋白质/g秸秆）和木聚糖酶550 U/g秸秆（相当于0.6 mg蛋白质/g秸秆），用0.05 mol/L HCL或Ca（OH）2上清液调整pH至4.8， 在50°C和180 r/min的摇床中酶解48 h，酶解结束后100°C处理30 min使酶解反应终止，酶解产物50°C烘干，粉碎。

1.2.4 指标测定方法

1.2.4.1 还原糖测定 取处理后秸秆5.0000 g，加入50 mL蒸馏水，浸泡24 h，滤纸过滤，取滤液测还原糖，采用 DNS 法（Miller，1959）。

1.2.4.2 木质纤维素的测定 采用滤袋法。中性洗涤纤维（NDF）采用国标GB/T20806-2006；酸性洗涤纤维（ADF）采用Van Soest测定法；酸性洗涤木质素（ADL）采用国标GB/T20805-2006。计算方法：

式中：Y表示相对于处理前秸秆中各指标的含量；X表示处理秸秆中各指标的含量；W1表示处理后秸秆干物质重量；W2表示处理前秸秆干物质重量；

1.3 数据统计与分析 采用SPSS 20统计分析软件对各数据进行方差分析和Duncan’s多重比较，差异显著用p＜0.05表示，所有结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 氧化钙+2%氢氧化钠处理对秸秆酶解效果的影响 氧化钙+2%氢氧化钠正交试验结果及方差分析分别见表4和表5。由表4可知，RA＞RB＞RC＞RD，说明处理温度对玉米秸秆酶解作用影响最大，其次为处理时间，再次为氧化钙浓度，而液固比的影响较小。由表5可知各因素对还原糖的提高无显著影响。因此，根据正交表得出最佳处理条件为 A3B2C2D3，即处理温度 80 °C，时间 6 h，氧化钙浓度 9%，液固比 11∶1。

表4 氧化钙+2%氢氧化钠正交试验结果

表5 氧化钙+2%氢氧化钠正交试验结果的方差分析

2.2 氨水处理对秸秆酶解效果的影响 氨水正交试验结果及方差分析分别见表6和表7。由表6可知，RC＞RA＞RD＞RB，说明氨水浓度对玉米秸秆酶解作用影响最大，其次处理温度，再次液固比，而处理时间的影响较小。由方差分析表7可知，氨水浓度对还原糖得率有显著影响，其他各因素影响不显著。因此，根据正交表得出最佳处理条件为A4B2C4D2，即处理温度 80 °C，时间 12 h，氨水浓度15%，液固比 9∶1。

表6 氨水正交试验结果

表7 氨水正交试验结果的方差分析

2.3 双氧水处理对秸秆酶解效果的影响 双氧水正交试验结果及方差分析分别见表8和表9。由表8 可知，RC＞RD＞RB＞RA，说明双氧水浓度对玉米秸秆酶解作用影响最大，其次液固比，再次处理时间，而处理温度的影响较小。由方差分析表9可知，各因素对还原糖得率无显著影响。因此，根据正交表得出最佳处理条件为A1B2C3D4，即处理温度50°C，时间 4 h，双氧水浓度 4%，液固比13∶1。

表8 双氧水正交试验结果

表9 双氧水正交试验结果的方差分析

2.4 单一和复合化学处理对秸秆中木质纤维素含量的影响 根据上述正交试验结果得出各单一化学处理最佳条件为：9% 氧化钙 （上清液）+2%氢氧化钠以液固比11∶1，80°C处理 6 h；15% 氨水浓度以液固比 9∶1，80°C 处理 12 h；4%双氧水以液固比13∶1，50°C处理4 h。将单一和复合化学处理对比，结果见表10。由表10可知，未处理玉米秸秆中的纤维素含量为38.13%，半纤维素含量为30.52%，木质素含量为7.38%。与未处理组相比，除双氧水处理组外，不同处理组玉米秸秆中纤维素含量相对增加了0.28%～7.7%，半纤维素含量均显著降低（p＜0.05）；除氧化钙+氢氧化钠处理组，木质素含量显著降低 （p＜0.05），其中2%NaOH+CaO+双氧水+氨水+双氧水组半纤维素和木质素降解率最高，分别为72.94%（p＜0.05）和79.95%（p＜0.05）。氨水和双氧水处理均能显著提高木质素降解率，且二者复合处理效果更好；而低浓度氧化钙+氢氧化钠处理对木质素降解效果不显著，氧化钙+氢氧化钠与双氧水复合效果显著优于单独处理。

表10 不同处理对秸秆中木质纤维素含量及酶解后还原糖产量的影响

与未处理组相比，除双氧水和2%NaOH+CaO+氨水+双氧水（同时加入）组外，玉米秸秆酶解后所得还原糖均显著增加（p＜0.05）。与酶解未处理秸秆相比，氨水+双氧水及2%NaOH+CaO+双氧水+氨水+双氧水组酶解后还原糖含量提高6.02倍（p＜0.05）和 6.10倍（P ＜0.05）。与氨水组对比，2%NaOH+CaO+氨组酶解还原糖显著降低（p＜0.05），这表明碱与氨水复合处理具有负效应，同时碱与双氧水及氨水与双氧水复合处理具有正效应。

3 讨论

3.1 氧化钙+2%氢氧化钠处理对秸秆酶解效果的影响 氧化钙是一种来源广泛、价格低廉的原料，对处理过程中所产生的糠醛、乙酸等次生产物具有很好的解毒作用（Heredia-Olea等，2012；Cao等，2012）。氢氧化钠作为强碱，在高浓度高温的条件下，能够有效地去除木质素，且提高酶解效率（李忠等，2013；陈广银等，2011）。 而秸秆作为饲料资源开发，对化学试剂的浓度范围有严格的要求，两种低浓度碱结合在秸秆预处理应用方面有着广阔的前景 （Zhang等，2011）。本试验结果显示，在9%氧化钙（上清液）+2%氢氧化钠以液固比11∶1，80°C处理6 h条件下对玉米秸秆酶解效果较显著，但是对木质素去除效果不显著，其原因是低浓度碱只能对纤维素起到润涨作用，以促进酶解。欧阳嘉等（2010）曾用20%（m/m）氢氧化钠，80°C处理1 h，总糖得率较未处理秸秆提高46.66%，而本研究使酶解还原糖含量较未处理秸秆提高2.25倍。

3.2 氨水处理对秸秆酶解效果的影响 一般而言，将秸秆浸在10%（m/m）左右的氨水中处理24～48 h，可以脱除大部分木质素和对发酵不利的乙酰基。本研究结果显示，氨水处理在最佳条件下（15% 氨水、液固比 9∶1、80 °C 处理 12 h），对玉米秸秆酶解效果显著。据报道，氨水处理可破坏玉米秸秆中木质素和多糖间的结合键，增加纤维素含量 （易守连，2010）。本研究结果表明，氨水浓度对玉米秸秆酶解作用影响最大，且随着氨水浓度的增加预处理玉米秸秆酶解后还原糖含量显著增加。李静等（2011）用15%氨水，在40°C下处理39 h，还原糖得率为3.23%，而本研究使还原糖得率提高了4倍，取得了比较满意的结果。

3.3 双氧水处理对秸秆酶解效果的影响 双氧水作为强氧化剂，遇热分解成水和氧气，作为秸秆饲料处理具有绿色和无残留的优点。本研究结果显示，4%双氧水、 液固比13∶1、50°C处理4 h对玉米秸秆酶解效果不显著。郭佩玉等（1995）报道，双氧水处理秸秆是不可行的；但是，通过电镜观察其对表皮纤维细胞的作用效果甚小。

3.4 单一和复合化学处理对秸秆中木质纤维素和酶解还原糖含量的影响 本试验结果显示，氨水单独处理、低浓度碱与双氧水、氨水与双氧水复合处理均能提高木质素降解率和酶解的得糖率；碱与氨水复合处理效果小于单独处理，且对添加次序有严格要求，说明氨水与碱复合处理有负效应，其原因为氨水遇碱促进了氨的分解。由于碱的润涨，木质纤维素间的酯键发生皂化，而醚键发生分离，进而溶解出半纤维素，从而有利于酶和纤维素的接触，提高纤维素的糖化效率，从而提高还原糖产量（林有胜等，2009）。徐忠等（2004）的研究表明，10%氨水处理大豆秸秆24 h，使纤维素含量提高70.27%，半纤维素降解41.45%，木质素降解30.16%。本研究利用15%氨水处理玉米秸秆12 h，秸秆中纤维素含量提高5.87%，半纤维素降解49.61%，木质素降解44.31%。2%NaOH+CaO+双氧水+氨水+双氧水复合处理玉米秸秆，木质素降解率最高可达79.95%，酶解后还原糖含量达484.61 mg/g干物质。

4 结论

通过单一和复合处理对比表明，碱与双氧水复合处理效果显著优于单独处理；氨水在低温、低浓度条件下单独处理秸秆能显著提高酶解还原糖得率；低浓度氨水与双氧水复合处理效果优于2%NaOH+CaO与双氧水复合处理；2%NaOH+CaO+双氧水+氨水+双氧水复合处理对木质素和半纤维素去除效果最佳。经过碱和双氧水复合处理后，秸秆中还原糖含量提高，木质纤维素降低，为秸秆在单胃动物中的应用奠定了基础。