黑果枸杞水提取物抑制UVB辐射后HaCaT细胞凋亡及p16、p53蛋白表达

张钦宁 燕华玲 任立汆 加杨娥 王睿智

柴达木黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)，系茄科枸杞属，生物学价值高，可食用可入药。柴达木黑果枸杞水提物中含有色素、枸杞多糖、维生素、氨基酸等多种营养成分，现代医学证实黑果枸杞果实中的色素具有清除自由基，抗氧化，延缓衰老的作用[1]，但具体机制不甚清楚。目前对柴达木黑果枸杞的研究大多集中在抗氧化、降血糖、抗疲劳、调节免疫等方面，在抗衰老方面研究较少。对UVB辐射后HaCaT细胞中p16、p53蛋白表达的影响及柴达木黑果枸杞水提物减轻UVB辐射损伤HaCaT细胞的机制尚未见报道。故本实验研究黑果枸杞水提取对UVB诱导HaCaT细胞凋亡及p16、p53蛋白表达的影响，探讨其可能减轻UVB辐射损伤的机制。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂 柴达木黑果枸杞(青海诺蓝杞生物科技开发有限公司)；HaCaT细胞(南京凯基生物科技发展有限公司)；TL20W/12 紫外线 UVB 灯管(飞利浦) ；台湾路昌 UVB 辐照度监示器；X-Mark 型 BIO-RAD 酶标仪、凝胶成像系统(BIO-RAD公司)；凋亡检测试剂盒(美国BD Pharmingen公司)；Anti-p16 ARC antibody(ab51243)、Anti-p53 antibody(ab194736)、Anti-β- actin antibody(ab8227)(英国Abcam公司)，Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(proteintech公司)，RIPA裂解液、BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 研究方法

1.2.1 HaCaT细胞的培养 以含10%胎牛血清的 DMEM 为培养基(内含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素) ，接种于培养瓶后，置于37℃ 5% CO2饱和湿度的培养箱中，当细胞达90%融合时传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 实验分组及操作方法 随机分为3组，“对照组”；“UVB组”；“UVB+黑果枸杞水提物”。黑果枸杞水提取物粉末以含10%胎牛血清的DMEM培养基为溶剂，配制成2 mg/mL浓度(根据预实验选择)，并用0. 22 μm 孔径过滤器过滤，现配现用，辐射前6 h加入。空白组用锡箔纸覆盖，3组同时置于UVB灯管的正下方，距离20 cm，强度为30 mJ/cm2。辐射后继续培养12 h，用于流式细胞仪进行检测；辐射后24 h提取蛋白进行Western blot检测。单独重复5次。

1.2.3 MTS法检测细胞增殖 96孔板内HaCaT细胞达到80%～90%融合时，将细胞进行分组处理后，继续培养12 h。然后每孔加入MTS溶液20 μL，37℃ 5% CO2培养箱继续孵育3 h。终止培养后，酶标仪上选择490 nm波长测定并记录各孔吸光度值。每组单独重复6次。

1.2.4 细胞凋亡率检测 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化各组细胞，提前预冷的PBS洗2次，将细胞重悬于100 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入400 μL Binding Buffer，1h内用流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot检测p16和p53蛋白表达水平 各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用预冷的PBS洗2次，细胞中加入含PMSF的蛋白裂解液(蛋白酶抑制剂∶蛋白裂解液为1∶100)，轻轻吹打，置于冰上裂解30 min，直至液体清亮，4℃、12000 r/min离心取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液，放入沸水中煮10 min，使蛋白变性。制备12% SDS-PAGE凝胶，4℃过夜。蛋白定量后，每槽加入20 μg蛋白，各组蛋白离心后上样，电泳，80V恒压电泳2 h，恒压100V转膜2 h，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入一抗4℃摇床孵育杂交过夜(p16浓度为1∶1000；p53浓度为1∶2000)，复温1 h，TBST震荡洗膜6次，6 min/次，辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗，室温摇床下孵育2 h，TBST震荡洗膜，加入ECL发光液，暗视下显影，荧光强度代表蛋白样品的相对含量。

2 实验结果

2.1 细胞增殖检测 UVB照射组A值较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；黑果枸杞水提物组A值较UVB组升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。提示黑果枸杞水提物可减轻UVB辐射HaCaT细胞引起的细胞增殖率下降，但不能完全抑制UVB的损伤。

表1 MTS检测细胞增殖

2.2 流式细胞仪检测 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率结果见表2及图1， UVB辐射后的细胞凋亡率明显增加，黑果枸杞水提物组较UVB组细胞凋亡率明显下降，说明黑果枸杞水提物能够降低UVB辐射后HaCaT细胞的凋亡。

表2 黑果枸杞水提物对HaCaT细胞凋亡率的影响

注：#与对照组比较，P<0.05；*与UVB组比较，P<0.05

图1 各组HaCaT细胞凋亡率比较

2.3 Western blot检测 Western blot检测p16和p53蛋白表达结果见图2，UVB组与对照组比较p16和p53蛋白表达明显升高，黑果枸杞水提物2 mg/mL组与UVB组比较，p16和p53蛋白表达明显下降，说明黑果枸杞水提物可能通过降低p16和p53蛋白表达来降低UVB辐射HaCaT细胞的光损伤(图3、4)。

图2 黑果枸杞水提物对HaCaT细胞p16和p53蛋白表达水平的影响

注：#与对照组比较，P<0.05；*与UVB组比较，P<0.05

注：#与对照组比较，P<0.05；*与UVB组比较，P<0.05

3 讨论

皮肤光老化(skin photoaging)是指皮肤长期在紫外线(ultraviolet,UV)的辐射下导致皮肤发生形态学、组织学和生理学的改变。长期居住在高原地区，光老化现象严重，在光暴露部位，如面、颈、手背、前臂以及上胸部出现皮肤弹性丧失、皱纹增多粗深、皮肤粗糙、色素异常、毛细血管扩张、皮肤无光泽或呈灰黄色，甚至导致皮肤癌症。目前研究证实光老化主要是由于UV辐射改变DNA、细胞抗氧化平衡、信号转导通路、免疫学、细胞外基质(ECM)。UV诱导的光老化DNA的改变包括紫外线辐射诱导嘧啶二聚体和肿瘤抑制基因p53的损失[2]。现研究皮肤光老化涉及MAPK、TGFβ1及NF-κB等多条信号通路[3]。

UVB是引起皮肤光老化主要的因素，主要的靶细胞是皮肤第一道防线的角质形成细胞。本研究证实黑果枸杞水提物可减轻UVB辐射HaCaT细胞引起的细胞增殖率下降，并明显降低UVB诱导HaCaT细胞的凋亡率。减少UVB的照射损伤是预防光老化的重点。本研究结果提示在单次UVB照射中，黑果枸杞水提物虽不能完全抑制UVB的损伤，但可减轻UVB辐射后HaCaT细胞的损伤。单次UVB的照射仅引起光损伤，长期的UV照射则可引起光老化，黑果枸杞水提物这种减少光损伤的作用，推测其可减少光老化。现研究证实黑果枸杞中多种成分，如原花青素、酚类、黄酮类、多糖等多种成分具有抗氧化作用[4-9]，其中黄酮类物质较难溶于水，其余物质均易溶于水。但现阶段研究集中在这些成分自由基清除能力及炎性物质的研究上，未见对于细胞衰老相关蛋白的研究。

本研究证实UVB照射后HaCaT细胞p16、p53蛋白表达升高。p16基因位于9PH区,其作用机制主要与其编码蛋白调控细胞增殖有关，其基因产物p16蛋白可与cycilnD竞争结合细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)，直接作用于cycilnD/Rb/CDK4的反馈回路而阻止细胞增殖。与闵玮等[10]UVB照射HaCaT细胞后p16蛋白水平有所增高相一致。p53是重要的肿瘤抑制基因，其表达的p53蛋白可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。

黑果枸杞水提物减少UVB辐射引起HaCaT细胞凋亡率增加，p16和p53蛋白表达增加、延缓细胞衰老。研究证实芍药苷可通过抑制p53在人类角质细胞的激活从而抑制UVB诱导的皮肤损伤[11]。p53的过度表达还使其成为一种有实用价值的标志物，用于鉴别颞骨鳞状细胞癌高危个体[12]。p16是细胞周期的调控者，它与许多肿瘤的形成和发展关系密切，其突变、缺失、甲基化广泛存在于各种肿瘤中，很可能是一种在肿瘤发生中起重要作用的肿瘤抑制基因[13]。黑果枸杞水提物可抑制UVB照射后HaCaT细胞p16、p53蛋白表达，黑果枸杞水提物可能具有抑制光相关肿瘤的作用，需研究证实。

光老化是一个复杂的过程，导致DNA损伤，不仅包括衰老相关蛋白p16、p53的异常表达，还涉及其他蛋白的异常。李文静等发现5种蛋白参与光老化，分别是热休克蛋白B1(Heat shock protein B1,HSPB1)、膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)、角蛋白80(Keratin，type II cytoskeletal80，K2C80)、丝裂原激活的蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase3，MK03)和谷胱甘肽S转移酶A2(Glutathione S-transferase A2，GSTA2)，其中HSPB1、ANXA2、K2C80和MK03在老年人曝光部位的表皮中高表达而GSTA2在非曝光部位表皮中高表达[14]。

有针对性的寻找安全、高效的防光损伤的天然产物有十分重要的意义。大量天然植物防光研究的结果肯定了中药及提取物对抗光损伤的作用，天然植物及提取物对抗光损伤的作用与其所含的多糖、维生素、酚类化合物(黄酮、酚、酚酸、原花色素、单宁等)有很大关系[15，16]。而据文献报道，黑果枸杞不仅含有多糖，其含有独特的原花青素、花色苷、总多酚等营养成分，抗氧化作用强[17]。除此之外，黑果枸杞中的类胡萝卜素、核黄素、抗坏血酸、硫氨素和烟酸这些物质可能也参与了抗氧化反应[18]。研究表明，每克黑果枸杞中总抗氧化性的维生素C当量为109.73 mg[19]。维生素C作为抗氧化剂，可修复皮肤皱纹、改善皮肤粗糙等[20]。研究报道，维生素C还有效地拮抗紫外线诱导的细胞凋亡[21]。现阶段黑果枸杞在食品、药品方面的利用较欠缺，相比而言，维生素C价格便宜，易于购买使用。但柴达木黑果枸杞不仅可防光损伤、具有抗氧化作用，还可降血糖、抗疲劳、调节免疫，开发后其生态价值、药用价值、经济价值相当可观[22]。

本研究证实黑果枸杞水提物能显著降低p16、p53蛋白表达，从分子水平去探讨抗衰老的机制，为中药防治衰老提供了一定的科学理论依据，为开发抗衰老中药、发扬祖国的传统医学提供了新的思路。为寻找与皮肤光老化相关的特异性生物效应指标提供了线索，为指导皮肤美容奠定了基础。