P62和Caspase-8在皮肤基底细胞癌组织中的表达

张 晶 王 鑫 王朋敏 郭 培 常轶可 刘 青 刘惠民 苗国英

皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)在皮肤非黑素肿瘤中发病率占第一位，近年来，皮肤肿瘤发病率呈现逐渐升高的趋势。

Caspase-8是一种天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，几乎可以引发所有凋亡级联反应下游的凋亡相关因子，诱发凋亡，是Caspase家族中重要的凋亡启动因子。P62/SQSTM1是一种多功能泛素化结合的接头蛋白，由P62/SQSTM1基因所编码，参与组成细胞内多种蛋白质复合物，广泛参与细胞内的自噬、凋亡等多种病理生理过程，常被称为自噬蛋白。

细胞恶性增殖以及免疫逃逸是造成肿瘤病情进展的关键因素，而在这一过程中细胞凋亡调控发挥了至关重要的作用。研究发现，P62在人类多种恶性肿瘤中存在异常增多，其在非乳腺癌、小细胞肺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞中表达量明显高于正常细胞[1]。Zeng等研究发现脑部胶质母细胞瘤中Caspase-8和P62共同参与细胞凋亡过程，其中P62主要通过作用于Caspase-8来调节Caspase介导的级联反应，从而影响细胞凋亡过程[5]。国外有研究表明，P62通过Cullin3作用于死亡诱导信号复合体(death-induring signaling complex，DISC)促进聚泛素化，激活细胞内Caspase-8，从而达到影响机体Caspase-8的细胞凋亡的目的[2]。Caspase-8和P62分别为凋亡蛋白和自噬相关蛋白，在BCC中的表达及与凋亡和自噬的关系尚无相关报道。

本实验拟采用免疫组织化学染色法，试图通过检测凋亡相关蛋白Caspase-8和自噬相关蛋白P62在皮肤BCC的表达，探究两者在BCC的发生、发展过程中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2016年3月至2017年5月河北工程大学附属医院皮肤科BCC患者的石蜡组织标本共45例作为实验组，其中，男19例，女26例。年龄17～83岁，平均(61.9±13.9)岁；所有蜡块均经两位资深病理医生复查并明确诊断，重复检查的病例仅将首次资料纳入实验。另选取本院整形外科手术切除的正常皮肤组织标本10例，制成石蜡标本作为对照研究，其中，男4例，女6例。年龄40～74岁，平均(59.4±13)岁。实验组和对照组选取的标本均位于头面部，无其他皮肤病或系统性疾病，术前无局部治疗史。

1.2 主要试剂兔抗人P62单克隆抗体(Abcam公司)工作浓度为1∶500；兔抗人Caspase-8单克隆抗体(Abcam公司) 工作浓度为1∶200；兔SP试剂盒、DAB显色试剂盒和PBS粉(pH值7.2～7.4)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸钠抗原修复液(50×)购自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3 实验方法 组织切片的制备将石蜡组织标本4 μm连续切片，采用免疫组化聚合物酶标二抗法，行抗原修复液水浴修复抗原，具体步骤参照试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染。实验分组：正常皮肤组、BCC组。正常皮肤为对照组。采用0.01 mol/L的PBS(pH值7.4)缓冲液代替一抗作为阴性对照， P62和Caspase-8分别选用口腔鳞癌和扁桃体组织作为阳性对照。

1.4 结果判定 由至少2名病理科诊断医师对免疫组织化学染色切片进行评估。在显微镜下观察BCC细胞和正常表皮着色情况，结果评估根据Fromowitz[3]的综合计分法进行，每张阳性切片随机选取10个高倍视野(400×)。按阳性细胞的百分比分级：5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>76%为4分；并按染色强度计分：无染色为0分，浅染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。两项结果计分相加计算总得分，可分为四个等级：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6-7分为强阳性(+++)，计算阳性表达率时，总得分≥2判定为阳性。

1.5 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件对实验结果进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差表示，等级资料采用秩和检验、Spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Caspase-8在BCC和正常皮肤中的表达 Caspase-8在细胞中的表达主要定位于胞质。正常皮肤组织中有9例阳性表达，多呈中度阳性； 20例BCC中Caspase-8呈阳性表达，且染色强度多为弱阳性和中度阳性。BCC中Caspase-8阳性表达低与正常皮肤组织有统计学差异(表1，图1)。

表1 Caspase-8在BCC和正常皮肤中的表达

注 ：与正常皮肤相比，Z=-2.711，P<0.05

2.2 P62在BCC和正常皮肤中的表达P62在细胞中的表达多数位于细胞质，部分位于细胞核。39例BCC中P62呈阳性表达，染色自弱阳性至强阳性，以中度阳性染色为主；正常皮肤组织中有4例为阳性表达，BCC中P62的阳性表达高于正常皮肤组织(图1，表2)，差异有统计学意义。

表2 P62在BCC和正常皮肤中的表达

注：与正常皮肤相比，Z=-2.951，P<0.05

2.3 Caspase-8与P62的相关性分析 经Spearman秩相关分析表明，BCC中Caspase-8的阳性表达水平和P62的阳性表达水平呈负相关(表3)。

表3 Caspase-8和P62的相关性

注：秩相关性分析，r=-0.322，P<0.05

3 讨论

近年来，研究表明肿瘤细胞凋亡的机制以细胞外途径为主，其中又以Caspase家族介导的级联反应为主，凋亡的所有信号通路均需激活Caspase酶系这一终极步骤，诱导激活下游的酶促级联反应，引发细胞凋亡。Athar等[4]研究表明，通过调控Fas的表达和激活Caspase-8而诱发细胞凋亡，可阻止由于紫外线诱导的BCC的发生。

a：正常皮肤组织中Caspase-8的表达；b：BCC中Caspase-8的表达；c：阳性对照中Caspase-8的表达；d：阴性对照中Caspase-8的表达；e：正常皮肤组织中P62的表达；f：BCC中P62的表达；g：阳性对照中P62的表达；h：阴性对照中P62的表达

P62聚集物是细胞内的信号中心，激活TRAF6-NF-KB途径，可能推动Caspase-8相关复合物和下游Caspase途径凋亡效应器的形成。P62在多种肿瘤中超表达，并与肿瘤易发生转移有关。Caspase-8和P62分别为凋亡蛋白和自噬相关蛋白，在BCC中的表达及与凋亡和自噬的关系尚无相关报道。曾有研究发现肿瘤中二者之间存在关系，在胶质母细胞瘤的U87MG细胞中，经给予蛋白抑制剂MG132，抑制细胞自噬活性，当P62蛋白表达升高，Caspase-8随之被激活，说明在Caspase-8的活化过程中，P62起到很关键的作用[5]。Xuel等[6]使生长因子缺乏或给予阿糖胞苷处理交感神经元时，细胞的自噬活性发生明显提高，并出现了细胞凋亡现象；使用自噬抑制剂处理后，神经元细胞内的反应停止在凋亡过程中的活化阶段而不再继续进行，提示凋亡的执行依赖于自噬过程。

本研究显示在BCC组织中，Caspase-8在癌组织表达明显低于正常上皮组织，提示BCC组织中存在凋亡异常；而P62在BCC组织中的阳性率明显高于正常对照，提示Caspase-8和P62的可能与BCC的发生、发展相关。

为进一步探讨P62在BCC发生过程中的作用，我们对Caspase-8和P62的表达相关性做出了分析。通过统计学分析，BCC中Caspase-8和P62的表达呈现负相关，推测P62可能通过作用于Caspase-8，通过影响其凋亡的泛素化过程，从而影响凋亡下游的级联反应，进而影响机体肿瘤的凋亡过程。有研究表明，CDK1诱导的P62磷酸化缺陷会增加肿瘤发生的概率，并增强细胞增殖。P62通过参与Ras、MAPK、NF-kB等信号通路的调节，促进肿瘤迁移和增殖。

然而至今为止，在皮肤BCC中的P62对凋亡调节机制的研究资料极为有限，因此对P62在皮肤肿瘤中的作用机制可做进一步研究。