P62和Caspase-8在皮肤基底细胞癌组织中的表达

2018-11-30 01:15王朋敏常轶可刘惠民苗国英
中国麻风皮肤病杂志 2018年11期
关键词:级联中度染色

张 晶 王 鑫 王朋敏 郭 培 常轶可 刘 青 刘惠民 苗国英

皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)在皮肤非黑素肿瘤中发病率占第一位,近年来,皮肤肿瘤发病率呈现逐渐升高的趋势。

Caspase-8是一种天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶,几乎可以引发所有凋亡级联反应下游的凋亡相关因子,诱发凋亡,是Caspase家族中重要的凋亡启动因子。P62/SQSTM1是一种多功能泛素化结合的接头蛋白,由P62/SQSTM1基因所编码,参与组成细胞内多种蛋白质复合物,广泛参与细胞内的自噬、凋亡等多种病理生理过程,常被称为自噬蛋白。

细胞恶性增殖以及免疫逃逸是造成肿瘤病情进展的关键因素,而在这一过程中细胞凋亡调控发挥了至关重要的作用。研究发现,P62在人类多种恶性肿瘤中存在异常增多,其在非乳腺癌、小细胞肺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞中表达量明显高于正常细胞[1]。Zeng等研究发现脑部胶质母细胞瘤中Caspase-8和P62共同参与细胞凋亡过程,其中P62主要通过作用于Caspase-8来调节Caspase介导的级联反应,从而影响细胞凋亡过程[5]。国外有研究表明,P62通过Cullin3作用于死亡诱导信号复合体(death-induring signaling complex,DISC)促进聚泛素化,激活细胞内Caspase-8,从而达到影响机体Caspase-8的细胞凋亡的目的[2]。Caspase-8和P62分别为凋亡蛋白和自噬相关蛋白,在BCC中的表达及与凋亡和自噬的关系尚无相关报道。

本实验拟采用免疫组织化学染色法,试图通过检测凋亡相关蛋白Caspase-8和自噬相关蛋白P62在皮肤BCC的表达,探究两者在BCC的发生、发展过程中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2016年3月至2017年5月河北工程大学附属医院皮肤科BCC患者的石蜡组织标本共45例作为实验组,其中,男19例,女26例。年龄17~83岁,平均(61.9±13.9)岁;所有蜡块均经两位资深病理医生复查并明确诊断,重复检查的病例仅将首次资料纳入实验。另选取本院整形外科手术切除的正常皮肤组织标本10例,制成石蜡标本作为对照研究,其中,男4例,女6例。年龄40~74岁,平均(59.4±13)岁。实验组和对照组选取的标本均位于头面部,无其他皮肤病或系统性疾病,术前无局部治疗史。

1.2 主要试剂兔抗人P62单克隆抗体(Abcam公司)工作浓度为1∶500;兔抗人Caspase-8单克隆抗体(Abcam公司) 工作浓度为1∶200;兔SP试剂盒、DAB显色试剂盒和PBS粉(pH值7.2~7.4)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;柠檬酸钠抗原修复液(50×)购自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3 实验方法 组织切片的制备将石蜡组织标本4 μm连续切片,采用免疫组化聚合物酶标二抗法,行抗原修复液水浴修复抗原,具体步骤参照试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木精复染。实验分组:正常皮肤组、BCC组。正常皮肤为对照组。采用0.01 mol/L的PBS(pH值7.4)缓冲液代替一抗作为阴性对照, P62和Caspase-8分别选用口腔鳞癌和扁桃体组织作为阳性对照。

1.4 结果判定 由至少2名病理科诊断医师对免疫组织化学染色切片进行评估。在显微镜下观察BCC细胞和正常表皮着色情况,结果评估根据Fromowitz[3]的综合计分法进行,每张阳性切片随机选取10个高倍视野(400×)。按阳性细胞的百分比分级:5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>76%为4分;并按染色强度计分:无染色为0分,浅染色为1分,中度染色为2分,强染色为3分。两项结果计分相加计算总得分,可分为四个等级:0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中度阳性(++),6-7分为强阳性(+++),计算阳性表达率时,总得分≥2判定为阳性。

1.5 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件对实验结果进行统计学处理,计量资料采用均数±标准差表示,等级资料采用秩和检验、Spearman秩相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Caspase-8在BCC和正常皮肤中的表达 Caspase-8在细胞中的表达主要定位于胞质。正常皮肤组织中有9例阳性表达,多呈中度阳性; 20例BCC中Caspase-8呈阳性表达,且染色强度多为弱阳性和中度阳性。BCC中Caspase-8阳性表达低与正常皮肤组织有统计学差异(表1,图1)。

表1 Caspase-8在BCC和正常皮肤中的表达

注 :与正常皮肤相比,Z=-2.711,P<0.05

2.2 P62在BCC和正常皮肤中的表达P62在细胞中的表达多数位于细胞质,部分位于细胞核。39例BCC中P62呈阳性表达,染色自弱阳性至强阳性,以中度阳性染色为主;正常皮肤组织中有4例为阳性表达,BCC中P62的阳性表达高于正常皮肤组织(图1,表2),差异有统计学意义。

表2 P62在BCC和正常皮肤中的表达

注:与正常皮肤相比,Z=-2.951,P<0.05

2.3 Caspase-8与P62的相关性分析 经Spearman秩相关分析表明,BCC中Caspase-8的阳性表达水平和P62的阳性表达水平呈负相关(表3)。

表3 Caspase-8和P62的相关性

注:秩相关性分析,r=-0.322,P<0.05

3 讨论

近年来,研究表明肿瘤细胞凋亡的机制以细胞外途径为主,其中又以Caspase家族介导的级联反应为主,凋亡的所有信号通路均需激活Caspase酶系这一终极步骤,诱导激活下游的酶促级联反应,引发细胞凋亡。Athar等[4]研究表明,通过调控Fas的表达和激活Caspase-8而诱发细胞凋亡,可阻止由于紫外线诱导的BCC的发生。

a:正常皮肤组织中Caspase-8的表达;b:BCC中Caspase-8的表达;c:阳性对照中Caspase-8的表达;d:阴性对照中Caspase-8的表达;e:正常皮肤组织中P62的表达;f:BCC中P62的表达;g:阳性对照中P62的表达;h:阴性对照中P62的表达

P62聚集物是细胞内的信号中心,激活TRAF6-NF-KB途径,可能推动Caspase-8相关复合物和下游Caspase途径凋亡效应器的形成。P62在多种肿瘤中超表达,并与肿瘤易发生转移有关。Caspase-8和P62分别为凋亡蛋白和自噬相关蛋白,在BCC中的表达及与凋亡和自噬的关系尚无相关报道。曾有研究发现肿瘤中二者之间存在关系,在胶质母细胞瘤的U87MG细胞中,经给予蛋白抑制剂MG132,抑制细胞自噬活性,当P62蛋白表达升高,Caspase-8随之被激活,说明在Caspase-8的活化过程中,P62起到很关键的作用[5]。Xuel等[6]使生长因子缺乏或给予阿糖胞苷处理交感神经元时,细胞的自噬活性发生明显提高,并出现了细胞凋亡现象;使用自噬抑制剂处理后,神经元细胞内的反应停止在凋亡过程中的活化阶段而不再继续进行,提示凋亡的执行依赖于自噬过程。

本研究显示在BCC组织中,Caspase-8在癌组织表达明显低于正常上皮组织,提示BCC组织中存在凋亡异常;而P62在BCC组织中的阳性率明显高于正常对照,提示Caspase-8和P62的可能与BCC的发生、发展相关。

为进一步探讨P62在BCC发生过程中的作用,我们对Caspase-8和P62的表达相关性做出了分析。通过统计学分析,BCC中Caspase-8和P62的表达呈现负相关,推测P62可能通过作用于Caspase-8,通过影响其凋亡的泛素化过程,从而影响凋亡下游的级联反应,进而影响机体肿瘤的凋亡过程。有研究表明,CDK1诱导的P62磷酸化缺陷会增加肿瘤发生的概率,并增强细胞增殖。P62通过参与Ras、MAPK、NF-kB等信号通路的调节,促进肿瘤迁移和增殖。

然而至今为止,在皮肤BCC中的P62对凋亡调节机制的研究资料极为有限,因此对P62在皮肤肿瘤中的作用机制可做进一步研究。

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