振荡提取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定藻类中6种形态砷化合物

周志豪，黄振华，周朝生，陆荣茂，曾国权，陈星星

(浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江 温州 325005)

砷是一种普遍存在于藻类中主要的有害重金属元素之一，其毒性不仅与元素总量有关，还与其存在的化学形态密切相关[1]。As的化学形态包括高毒性的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)，低毒性的甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)和基本无毒的三甲基砷酸(TMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)和砷糖(AsS)。目前，对砷的形态分析主要集中在中药材、香菇，而藻类中As的相关研究主要集中在对其总量的测定，对于其形态分析研究较少。为对藻类样品中As的不同形态进行有效的分离测定，合适的分离手段和检测方法必不可少。HPLC具有分离高沸点、难挥发性的物质的优点，而且能设置不同分离程序；电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)具有灵敏度高、动态范围宽、干扰少、可连续测定等优点。因此，采用HPLC与ICP-MS联用技术建立同时快速检测藻类各形态As的分析方法，旨在为藻类中As的形态分析及其安全性评价提供参考[2-4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2016年9月～2016年12月间，在浙江苍南、洞头、平阳、瑞安、舟山六横苍洞、三门、临海、温岭采集了6个羊栖菜、9个海带、19个紫菜， 这3个品种共34个藻类样品。

AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ(含量分别为(28.0±1.1)、(38.8±1.1)、(75.7±1.2)、(52.9±1.8)、(25.1±0.8)、(17.5±0.4)μg ·g-1)国家计量科学研究院；磷酸二氢铵(优级纯)；双氧水(优级纯)；硝酸(优级纯)

1.2 仪器与设备

采用安捷伦7900电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定As；采用安捷伦1260HPLC和7900电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)联用测定砷的形态；ETHOS UP密闭微波消解仪(意大利Milestone公司)。

1.3 方法

1.3.1 HPLC-ICP-MS条件

HPLC条件：Hamilton PRPX-100阴离子交换柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)；流动相A：水，流动相B：25 mmol/L磷酸二氢铵溶液(以氨水调节pH值至8.0)；梯度洗脱程序：0～15min，100%A～100%B，15～20min，100%B～100%A；20～25min，100%A；流速1.0 mL/min；进样量50 μL。

1.3.2 样品前处理

用采样点海水清洗去除海藻表面附着物。4 ℃下运回实验室。超纯水冲洗数次，60 ℃烘干至恒重。磨碎，过60目筛于-20 ℃，密封避光保存待测[1,5]。分析过程以国家生物成分分析标准物质GBW10023(紫菜)进行质量控制。

1.3.3 总砷含量的测定

准确称取藻类样品1.000 g(精确到0.0001 g)于微波消解管中，加入6 mL优级纯硝酸，2 mL优级纯过氧化氢，采用微波消解仪消化至溶液澄清透明，消解程序见表1。消解程序结束后，待其冷却，取出消解管，于160 ℃赶酸至近干，用体积分数2 %硝酸定容至10 mL，过0.22μm滤膜，同时做样品空白，配制标准曲线溶液，用ICP-MS仪检测样品中总砷的含量。

1.3.4 提取方式的选择

设计了机械振荡装置，并研究了不同的振荡频率、振荡时间(180～360min)对6种形态砷化物的提取。

1.3.5 藻类样品中6种形态砷化合物的提取

准确称取2.0000 g(精确到0.0001 g)藻类样品于50 mL离心管中，加入30 mL 0.3 mol/L乙酸溶液提取，将藻类样品混合均匀后进行振荡提取，10000 r/min离心10min，收集上清液，将沉淀重复提取2次，合并上清液，将上清液于1 0000 r/min离心10min后过0.22 μm滤膜，40 ℃条件下浓缩至近干，用超纯水定容至10 mL，过0.22 μm滤膜进行HPLC-ICP-MS分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

样品中的AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ等砷形态化合物，会由于溶液中的不同的pH值而呈现不同的电性，从而影响其在柱子上的保留时间，本实验采用了Hamilton PRPX-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)阴离子交换柱对不同形态的As进行分离实验。选取了碳酸铵溶液、磷酸盐缓冲液及磷酸二氢铵溶液3种流动相进行分离。结果表明，AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ这6种形态砷在磷酸二氢铵溶液作用下，分离时间较短，峰形较佳；而在流动相磷酸盐缓冲液和碳酸铵溶液作用下，6种砷形态化合物并不能完全分离，AsC和AsB无法分开。另外实验还考察了磷酸二氢铵浓度对6种形态砷保留时间的影响，分别采用15、20、25、30和35 mmol/L，5种不同浓度的磷酸二氢铵溶液，对6种形态As的混标溶液进行梯度洗脱，结果如图1所示。由图1可知，当磷酸二氢铵浓度增大时，各形态As的保留时间表现各不相同，AsⅤ的保留时间快速的减少，DMA、MMA的保留时间缓慢的减少，AsC、AsB、AsⅢ的保留时间并没有太大变化，这表明磷酸二氢铵浓度增大时，对不同形态的砷洗脱能力并不完全相同；当磷酸二氢铵浓度达到25 mmol/L时，20min内6种形态的As达到基线分离，峰形较佳，已能完全满足测试要求，当度大于25 mmol/L时部分形态As的色谱峰开始出现重叠，而且流动相浓度过大，易在柱子内沉积堵塞，因此本实验采用25 mmol/L磷酸二氢铵为流动相[7]。

pH值对不同形态As的分离有较大的影响，实验考察了pH值对其保留时间的影响，结果发现：pH值在5.0～10.0范围时，6种形态的As可以较好地分离开，由于pH值增大有利于缩短分离时间，因此为了保证分离度的同时缩短分析时间，本实验选择pH值8.0。

图1 磷酸二氢铵浓度对6种形态As的色谱保留时间的影响

图2 磷酸二氢铵pH值对6种形态As的色谱峰保留时间的影响

2.2 提取剂的优化

对于多形态砷提取剂相关报道，常见的提取溶剂有水、低浓度酸、甲醇水等体系。本实验比较了不同提取溶剂的萃取效率，在实验中，发现采用甲醇/水(体积比1∶1)振荡提取时，各形态As的总提取效率有时会高达130%。这可能是因为甲醇溶剂提高了As的离子化效率，从而增强了As的信号值。另外采用甲醇溶剂会使得实际样品的提取液与标准溶液pH值存在差异，也就使得保留时间产生偏移，但是乙酸作为提取剂可以有效地避免这一现象。

2.3 提取方式的选择

振荡提取装置是实验室自我设计的装置，如图3所示。

13a1：提取管；13b：提取管配件；13a2提取管密封盖；12a：第一夹头；12b：第二夹头；12c：悬置部图3 振荡提取装置

经过实验测试，发现振荡频率在200 r/min；时间设置在200min，对藻类中砷的提取较完全。

2.4 方法线性范围与检出限

分别配制1、2、5、10、20、50 μg/L的系列砷形态混合标准溶液，在优化的HPLC条件下进行分析，得到标准曲线，如表1所示，6种形态的砷化合物的相关系数R2均大于0.9980。在优化的HPLC工作条件下，采用逐级稀释法以3倍信噪比测定检出限，AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的检出限分别为0.26、0.27、0.0.34、0.29、0.24、0.31 μg/L。

表1 6种砷化合物的标准曲线、检出限及精密度

2.5 方法的精密度

为考察方法的精密度，选择50 μg/L的6种砷形态的混合标样连续测定6次，按优化的实验条件进行分析，以相对标准偏差评价其重复性，如表1所示，6种形态砷化合物的相对标准偏差为1.6%～3.9%，均小于5%。

2.6 加标回收率

选择藻类样品进行研究，选择提取效果最好的0.3 mol/L乙酸溶液进行振荡提取，分别向其中加入低、中、高3种浓度的6种砷形态混合标准溶液，按优化的实验条件进行测定，如表所示。AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的加标回收率分别为92.5%～96.35%、94.2%～98.2%、89.1%～93.1%、85.1%～90.1%、92.1%～98.3%、88.1%～93.4%。

2.7 样品测定

AsC为砷胆碱、AsB为砷甜菜碱、AsⅢ为三价砷、DMA为二甲基砷、MMA为一甲基砷、AsⅤ为五价砷

图4 藻类样品的HPLC-ICP-MS色谱图

样品经过0.3 mol·L-1乙酸溶液振荡提取，如图1所示，发现羊栖菜砷的种类较多，在砷甜菜碱和五价砷之间有三个未知峰；其次是海带，除了一个三价峰以外，也有三个未知峰；紫菜中砷的种类较少，一个三价峰和一个未知峰，从图中还可以发现紫菜中有机砷占总砷比例比羊栖菜和海带都要大。

3 讨论

本研究发现在优化色谱条件时，AsC、AsB和 As(Ⅲ)并没有随着我们对流动相浓度改变，出峰时间而发生变化，因为在梯度洗脱程序：0～20min，100%A～100%B，而最晚出峰的As(Ⅲ)也仅2.6min，因此流动相溶液大部分为水溶液，而水溶液中，As(Ⅲ)、As(V)、DMA和MMA是以阴离子形式存在，而AsB和AsC是以阳离子形式存在[6]。因此，对于阴离子交换柱，在以磷酸二氢铵为流动相条件下，As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA和色谱柱固定相上的离子交换剂基团相互作用，二甲基砷以HA和A-各占一半的形式存在，因此在阴离子色谱柱上有一定保留；一甲基砷完全以HA-的形式存在，因此在阴离子色谱柱上保留强于二甲基，而As(V)部分已经以HA2-的形式存在，是这几种离子中保留最强的，按照作用力的大小，As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(V)依次被洗脱出来[8]。而AsC和AsB无法与离子交换剂的交换中心发生交换，只能随着流动相先流出，因此当As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA、AsC和AsB同时存在时，总是AsC和AsB最先出峰[7-9]。

萃取溶剂的选择。在研究样品提取溶剂时，刚开始考虑甲醇水作为提取溶剂，但我们发现甲醇水比例较难把握，较少对样品提取效率不高，多了甲醇具有弱变形性质，反而降低了提取效率，这可能是甲醇含量多了，提取出样品中有机物质，从而干扰了测定的精确性，并且要甲醇的增敏效应，必然在前处理中增加相应的操作步骤，给实验操作者带来一定劳动强度。其二，甲醇属于无色易挥发的液体，具有一定的毒性，对实验操作者身体健康有潜在的危害。其三，乙酸在作为提取溶剂时，与标准溶液在pH值上保持了一致，避免了样品峰的偏移，并且能有效的提取样品中的多形态砷[10-11]。

4 结论

建立了AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ6种形态As的HPLC-ICP-MS方法。6种不同形态的As的HPLC-ICP-MS方法。6种不同形态的As在20min内实现了基线分离。藻类中的As含量较低，且大部分以低毒的砷糖形式存在。振荡溶剂提取能同时将有机As和无机As提取出来，较客观地反映样品中As的形态分布。对于藻类样品中As的安全性评价而言，其形态分析比总量检测更为合理。本方法准确、可靠，可为藻类中As的形态分析及安全性评价提供参考。