响应面法优化头花蓼总黄酮的提取工艺

吴 婕，徐 高，吴学慧

(1.遵义师范学院 赤水河流域环境保护与山地农业发展协同创新中心，贵州 遵义 563006；2.贵州师范学院 化学与材料学院，贵州 贵阳 550018)

头花蓼(Polygonum Capitatum)，又名四季红[1]，属于多年生匍匐草本。它的主要化学成分有挥发油、酚酸类化合物、酯溶性化合物和黄酮类化合物等等[2-3]，其中黄酮类化合物不仅具有解毒、抗炎、降血糖等生理的功效，而且有抗癌、抗氧化、抗肿瘤的作用[4-5]。因此它具有很广的医药、保健品和化妆品市场。

目前，植物黄酮类化合物的提取的方法较多，主要有微波辅助浸提、超声辅助浸提、超临界流体萃取等等[6-9]。超声辅助浸提法具有效率高、操作简单、生产成本低等特点。本研究采用超声辅助浸提技术，探讨单因素：乙醇体积分数、提取时间、液固比和提取温度对头花蓼总黄酮得率的影响；并且首次借助实验设计软件Design-Expert 8.0.5优化出最佳的提取工艺参数，经过实验验证，此优化的工艺参数具有简单性和可靠性，它为头花寥总黄酮的工业化生产提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

头花蓼(施秉三元威门公司),芦丁标准品(贵州迪大科技有限责任公司),无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

L5s分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司),KQ5200DB型超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司)，RE201旋转蒸发仪(上海况胜实业发展有限公司),FZ102型微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，KL04A型离心机(上海京工实业有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮的提取工艺

精选头花寥→烘干40 ℃→研碎→过60目筛→称取2.0 g头花寥粉末→按照1.3.3的方法超声浸提总黄酮(超声波功率200W，超声频率40kHz)→抽滤→离心(2000 r/min)→合并滤液→浓缩→备用。

1.3.2 总黄酮的测定

按照“NaNO2-Al(NO3)3”显色法[5]，准确配制质量浓度为0.202 mg/mL的芦丁标准溶液，分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL放置于25 mL的容量瓶中；先加入1.0 mL 5% NaNO2，摇匀静置6min后，再加入1.0 mL10% Al(NO3)3，摇匀静置6min后，最后加入10.0 mL 4% NaOH，用去离子水定容，摇匀静置20min。在波长510 nm处，测定吸光度，将吸光度(Y)与芦丁标准品的浓度(X)进行线性数学回归。得到标准曲线方程：Y=10.372X-0.0091 (R2=0.9997)，可以计算出头花蓼总黄酮的质量浓度。

1.3.3 头花蓼总黄酮的单因素实验

超声辅助提取头花蓼总黄酮的单因素实验，分别称取2.0 g头花蓼粉末，固定提取条件：液固比20 mL/g，提取时间20min和提取温度60 ℃，考察不同体积分数的乙醇溶剂(35%、40%、45%、50%和55%)对头花蓼总黄酮得率的影响；固定提取条件：乙醇体积分数45%，提取时间20min和提取温度60 ℃，考察不同的液固比(15、20、25、30和35 mL/g)对头花蓼总黄酮得率的影响；固定提取条件：乙醇体积分数45%，液固比25 mL/g和提取时间20min，考察不同的提取温度(40、45、50、55和60℃)对头花蓼总黄酮得率的影响。固定提取条件：乙醇体积分数45%，液固比25 mL/g和提取温度50 ℃，考察不同的提取时间(15、20、25、30和35min)对头花蓼总黄酮得率的影响。按上述1.3.2方法，测定吸光度，得到头花蓼总黄酮得率公式如下：

头花蓼总黄酮得率P/%=C×V×100/M

式子：P/%-头花蓼总黄酮得率；C/(mg/mL)-头花蓼总黄酮质量浓度；V/(mL)-头花蓼总黄酮体积；M/mg-用于提取总黄酮的头花蓼质量。

1.3.4 响应面法优化法提取头花蓼总黄酮的Box-Behnken试验设计

以乙醇体积分数M(%)，提取时间U(min)，液固比T(mL/g)和提取温度S(℃)为考察因素，头花蓼总黄酮得率Q(%)为响应值，应用Design-Expert 8.0.5软件设计四因素三水平的Box-Behnken试验，确定超声辅助浸提头花蓼总黄酮的最优化条件。结果如表1～3所示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验设计与结果分析

按照1.3.3单因素实验方法，选取不同体积分数的溶剂乙醇、料固比、提取时间和提取温度，超声辅助浸提头花蓼总黄酮，分别进行3次平行实验，取平均值，以确定各考察因素的合适取值范围。实验结果如图1所示。

图1 提取头花蓼总黄酮的单因素实验结果Fig.1 The result of single factor experiment on extracting total flavonoids from polygonum capitatum

2.1.1 乙醇体积分数对头花蓼总黄酮得率的影响

如图1-a图可知，在乙醇体积分数为35%～45%范围内，头花蓼总黄酮得率随着溶剂乙醇的体积分数增加而升高；当乙醇体积分数为45%，得到最大的头花蓼总黄酮得率3.9%；继续增加溶剂的体积分数，头花蓼总黄酮得率却呈现缓慢的下降趋势。这是因为头花寥中黄酮类化合物易溶于乙醇溶剂，在一定的范围内，头花蓼总黄酮得率随乙醇体积分数的增大而增加；但是当乙醇体积分数过高时，会使有些醇溶性的色素和其它亲脂性强的成分溶出量继续增加，这些杂质会与头花蓼黄酮类化合物形成竞争，使头花蓼黄酮类化合物与乙醇-水分子结合的可能性下降，导致头花蓼总黄酮得率呈现出降低的趋势。在星点设计中，选择乙醇体积分数为40%～50%作为考察范围。

2.1.2 液固比对头花蓼总黄酮得率的影响

如图1-b图可知，当头花蓼与溶剂乙醇的液固比在15～25 mL/g范围内，头花蓼总黄酮得率随着液固比的增加而快速升高；当液固比为25 mL/g时，头花蓼总黄酮得率达到极大值4.15%；而后继续增加液固比，头花蓼总黄酮得率变化不大。因为增加液固比实质是增加单位质量的头花寥中乙醇溶剂量，增加的液固比势必增加物料内外溶液的总黄酮质量浓度差，促使头花寥溶出更多的总黄酮，但是液固比为25 mL/g时，单位质量的头花寥总黄酮已经基本溶出，故头花寥总黄酮得率变化不明显。在星点设计中，选择液固比为20 mL/g～30 mL/g作为考察范围。

2.1.3 提取温度对头花蓼总黄酮得率的影响

如图1-c图可知，温度增加可以增大溶解度和扩散系数，在40～50 ℃之间，头花寥黄酮化合物随着温度的升高而快速地溶出，头花寥总黄酮得率也随之增加；但是继续增加温度，黄酮类化合物的热不稳定结构在高温下容易被破坏，不利于提高头花寥总黄酮得率。在星点设计中，选择温度为45～55 ℃作为考察范围。

2.1.4 提取时间对头花蓼总黄酮得率的影响

如图1-d图可知，超声波的“空化作用”作用，可以加速头花寥植物组织和细胞的破裂,使得黄酮化合物更加容易溶出。在20min时，头花寥的总黄酮基本溶出，其得率达到最大值4.24%；如果继续延长提取时间，反而使更多的黄酮类化合物被氧化，导致头花寥总黄酮得率下降。在星点设计中，选择提取时间15～25min作为考察范围。

2.2 头花蓼总黄酮得率的多元二次回归模型的建立

在单因素试验结果基础上，以乙醇体积分数M(%)、提取温度S(℃)、液固比T(mL/g)和提取时间U(min)为考察因素，头花蓼总黄酮得率Q(%)为响应值，应用Design-Expert 8.0.5软件设计4因素3水平的Box-Behnken试验。“考察因素及实际操作物理量”和“星点设计试验结果”分别如表1和表2所示。

表1 考察因素及实际操作物理量Table 1 Code value and physical practice of independent variables levels

表2 星点设计试验结果Table 2 The central composite design and its results

运用Design-Expert 8.0.5软件的Box-Behnken设计出29个试验点。将试验所得数据带入Box-Behnken中，得到数学回归方程如下:

Q=-107.96542+1.57953×M+2.43617×S+0.77567×T+0.52903×U-0.005×M×S+0.0019×M×T-0.0008×M×U-0.016×S×T-0.0083×S×U-0.0003×T×U-0.014413×M2-0.016513×S2-0.00096333×T2-0.00186333×U2

对拟合的数学模型进行F检验方差分析，结果如表3所示。

表3 二项式拟合回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for binomial fitting quadratic regression model

表3(续)

注：*表示差异显著，P<0.05; **表示差异显著，P<0.01。

从表3可以看出，模型的R2= 0.825，P = 0.0032<0.01，表示回归数学模型具有极显著水平的统计学意义；模型失拟项比 P= 0.2311>0.05，S/N(信噪比)=6.981>4，表明该模型的实际拟合中的非正常误差所占的比例很小，失拟不明显，有较高的可信度。在一次项的F检验可以得到，各考察因素对头花蓼总黄酮得率影响的主次顺序为：乙醇体积分数(M)>液固比(T)>提取温度(S)>提取时间(U)。该数学回归模型预测的头花蓼总黄酮最优提取工艺参数(M,S,T,U)= (47.81%,45.41 ℃，29.98 mL/g，20.53min)，头花蓼总黄酮得率预测值Q为5.023%。考虑实际生产，改进的提取工艺为:乙醇体积分数48%，提取时间21min，液固比30 mL/g和提取温度46 ℃，经过平行的3次验证性试验，结果取其平均值，得到头花蓼总黄酮得率的验证值为5.00%，它与预测值相差0.023%，因此“星点设计-响应面法”选择的最佳工艺参数有较高的可信度。

3 结论

本研究，在超声提取头花寥总黄酮化合物的单因素试验基础上，利用Design-Expert8.0.5选取乙醇体积分数M(%)、提取温度S(℃)、液固比T(mL/g)和提取时间U(min)为变量，用它们与头花寥总黄酮得率Q(%)进行了模型回归分析，预测了提取头花寥总黄酮化合物最优工艺参数(M,S,T,U)= (47.81%，45.41 ℃，29.98 mL/g，20.53min)，头花蓼总黄酮得率预测值Q为5.023%。为验证实际工业中的可靠性，改进的提取工艺参数为:乙醇体积分数48%，提取温度46 ℃，液固比30 mL/g和提取时间21min，经过3次验证性试验，取平均值，得到头花蓼总黄酮得率的验证值为5.00%，它与预测值相差是0.023%，可以认为该模型预测的最佳工艺条件合理可靠。