酪蛋白磷酸肽副产物协同抗阻力运动对大鼠肌肉质量的影响

张 娜，郭庆启，刘晓飞，关桦楠，郭长慧，Ikeda SHINYA，石彦国,*

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.上海厨业食品有限公司，上海 200126；4.美国威斯康星大学麦迪逊分校食品科学系，美国 威斯康星 麦迪逊 53705）

1989年，Rosenberg[1]首次将随着年龄增加，肌肉质量和功能逐渐衰减的现象命名为肌肉衰减症（Sarcopenia）。我国人口日趋老龄化，预计2050年全球60 岁以上的人口将超过20亿，而其中5亿人口在中国[2]。经数据统计，50 岁患肌肉衰减症人群为1%～2%，70～75 岁患肌肉衰减症人群大约为20%，80 岁以上患肌肉衰减症人群则超过50%[3]。肌肉衰减症患者会出现力量减弱，运动平衡能力下降，以及糖尿病、心脏病、骨质疏松等症状。肌肉衰减症的发病机制有许多，其中蛋白质营养不良是其主要原因之一，其次是缺乏运动，任何年龄不运动都会引发肌肉质量和肌肉力量的减少[4-6]。

目前乳清蛋白以其亮氨酸、谷氨酰胺可增加肌肉细胞体积，抑制蛋白质分解，促进肌肉生长，促进肌肉蛋白质合成的作用而引起国内外研究者们的关注[7]。同时，一些研究发现乳源酪蛋白、大米蛋白、大豆蛋白等膳食蛋白也富含亮氨酸，具有促进肌肉蛋白质合成的作用[8-11]。亮氨酸被证明是肌肉蛋白质合成环节中翻译起始途径中的一个关键调节器[12]。

酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptide，CNPP）是碱性蛋白酶（Alcalase）水解酪蛋白，生产酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）过程中的副产物。CNPP是一系列重要生物活性肽的原材料，例如血管紧张素转化酶抑制肽、免疫调节肽以及抗血栓肽，并对某些疾病起到防治的效果[13]。然而在生产CPP的过程中却忽略了CNPP的营养价值，大量的CNPP均被当作饲料或废物弃去[14]。本研究通过检测发现每100 g CNPP含有8.3 g亮氨酸，与文献[8-9]中促进肌肉质量增加的其他蛋白质的亮氨酸含量相似，已有报道表明富含亮氨酸的肽或蛋白质具有抑制肌肉衰减的作用[15-17]，且比单独的亮氨酸更能有效促进肌肉质量的增加[10]；因此本研究拟对CNPP抑制肌肉衰减的可能性及其增加肌肉质量的能力进行表征。目前均以乳清蛋白作为改善肌肉衰减症的研究对象[8,11]，而国内的乳清蛋白均依靠进口，价格较贵[18]，选择另一种富含亮氨酸、价格低廉且促进肌肉质量增加的蛋白质或肽十分必要，因而对CNPP增加肌肉质量能力的探讨具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性大鼠购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（吉）2016-0005。

Alcalase 美国Sigma公司；干酪素 北京奥博星有限公司；乳清蛋白 郑州江大生物科技有限公司；动物饲料 长春亿斯实验动物技术有限公司；肝素钠上海士锋生物科技有限公司；乙醚 北京蒂华森科技有限公司；氢氧化钠 天津市大陆化学试剂厂；无水乙醇 天津化学试剂有限公司；氯化钙 天津市红岩化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LG10-2.4A离心分离机 北京京立离心机有限公司；XMTD-204恒温水浴锅 天津市欧诺仪器仪表有限公司；YC-015实验型喷雾干燥机 上海比朗仪器有限公司；ALC-110-4电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHS-2F pH计 上海精密科学仪器有限公司；Emotion-1型计算机断层扫描（computed tomography，CT）仪 上海西门子医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CNPP的制备

根据Adamson[19]和Zhao Li[20]等研究Alcalase水解酪蛋白制备CPP和CNPP的方法稍作修改。取适量酪蛋白缓慢加入适量蒸馏水中，使其质量浓度为30～70 g/L，调节pH值至7.0～9.0，放在温度为45～60 ℃水浴锅中搅拌溶解。当溶液pH值无明显变化后，加入2 mol/L Alcalase，同时维持溶液pH 7.0～9.0，酶解4 h后，水解液于100 ℃沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温，加入1% CaCl2和体积分数50%乙醇后，静置1 h。水解液4 000 r/min离心10 min，沉淀于干燥箱中烘干并研磨成粉末即CPP。上清液收集、浓缩，并通过喷雾干燥技术制成粉末即CNPP[19-20]。

1.3.2 实验分组

将80 只32 周龄雄性大鼠（体质量350～380 g）置于（23±2）℃实验室中自由摄入动物饲料并饮水，适应7 d。将大鼠随机分为饲喂CNPP组（样品组）和乳清蛋白组（对照组），每组又分为抗阻力运动组和自由活动组。由于相关研究表明运动可以预防肌肉质量的衰减，同时表明摄入营养协同抗阻力运动更易促进肌肉质量的增加[4,9]，因此本研究设置饲喂CNPP的抗阻力运动组，与饲喂CNPP的自由活动组进行比较，主要目的是为了探讨CNPP对大鼠肌肉质量是否具有促进作用，以及CNPP协同抗阻力运动是否比没有进行抗阻力运动且饲喂CNPP大鼠肌肉质量的促进作用更加显著。抗阻力运动组和自由活动组中的大鼠分别饲喂高（10.0 g/（kg·d））、中（5.0 g/（kg·d））、低（2.5 g/（kg·d））剂量CNPP或对照样品（乳清蛋白），空白组的大鼠只饲喂普通动物饲料，不饲喂CNPP和对照样品。每天上午8：00，分别取2 mL高、中、低剂量CNPP或乳清蛋白灌胃大鼠，空白组灌胃2 mL蒸馏水，灌胃后的大鼠可以自由采食动物饲料。

分别在第0、15、25、35、50天时，对抗阻力运动组和自由活动组中每只大鼠的躯干及下肢根部肌群、腰椎周围肌群、背部肌群、肩胛内侧肌群、上肢左侧根部肌群的肌肉横截面积以及血液中胰岛素、生长激素和睾酮水平进行测定。

1.3.3 抗阻力运动和自由活动训练

在踏步宽20 cm、高10 cm，10 节的台阶上进行抗阻力运动。将香肠抹在每节台阶上，使每节台阶只保留香肠的味道，并在最后的台阶上放0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的香肠引导大鼠爬楼梯。安排大鼠每天晚上17：00～18：00进行爬楼梯训练，每只大鼠进行3 组爬楼梯训练，爬10 节台阶为一组，每组训练结束后休息1 min，一周运动6 d。

自由活动组的大鼠除了在笼子里自由活动外，不做任何训练。

1.3.4 肌群横截面积的测定

采用横断螺旋CT仪，根据解剖学特征，测定样品组和对照组的大鼠在第0、15、25、35、50天时躯干及下肢根部肌群、腰椎周围肌群、背部肌群、肩胛内侧肌群、上肢左侧根部肌群的CT图像。采用10%水合氯醛以腹腔注射的方式麻醉大鼠（麻醉剂量为0.3 mL/100 g mb），然后将其以俯卧的姿势放在CT仪上进行扫描，扫描层厚设置0.5 cm。扫描得到的CT图像，通过CT仪的软件，用闭合曲线圈测定5 个肌群并计算得到肌群的横截面积。肌群横截面积增长量根据下式计算。

肌群横截面积增长量/cm2＝Sn－S0

式中：Sn和S0分别为第n天和0 d时肌群的横截面积/cm2。

1.4 数据分析

所有数据均采用SPSS 17.0软件进行分析。通过单因素方差分析（One-way ANOVA）中最小显著差异法进行显著性分析，显著性水平设定为P＜0.05。实验设5 次重复，结果表示为±s。

2 结果与分析

2.1 抗阻力运动组中饲喂高剂量CNPP或乳清蛋白的大鼠5 个肌群横截面积的CT扫描结果比较

采用CT技术对大鼠肌肉质量进行表征，其准确度、空间分辨率、灵敏度、可重复性较高，图像质量清晰且无创伤、无危险[21-22]，更重要的是其可精确区分脂肪、骨骼、软骨组织以及肌肉[23]。根据文献[10]，本研究选择5 个具有代表性的肌群进行检测，不仅考察样品对于动物不同肌群的效果，且对动物同一个肌群横截面积的增长情况进行了重点研究。

为了观察大鼠5 个肌群横截面积的增长情况，对第50天时抗阻力运动组中饲喂高剂量CNPP或乳清蛋白的大鼠5 个肌群横截面积的CT扫描图，与0 d时检测得到空白组大鼠的肌群横截面积的CT扫描图进行比较，结果如图1所示。

图1 抗阻力运动组中大鼠的5 个肌群横截面积的CT扫描图Fig.1 CT scanning of the cross-sectional area of five muscle groups of RE rats

根据图1可以观察到第50天抗阻力运动组中饲喂CNPP或乳清蛋白的大鼠5 个肌群的横截面积均大于0 d时各肌群的横截面积。除肩胛内侧肌群之外，其他4 组饲喂CNPP的大鼠的肌群横截面积均大于乳清蛋白组。可以初步判断，补充CNPP或乳清蛋白并在抗阻力运动的协同下可以促进肌肉质量的增加。为了更准确表明大鼠肌肉增长情况，分别计算出第15、25、35、50天时每只大鼠的肌肉横截面积增长量，如图2、3所示。

2.2 饲喂CNPP时间对自由活动组大鼠5 个肌群横截面积的影响

图2 自由活动组中饲喂CNPP的大鼠的5 个肌群横截面积增长量Fig.2 Increases in cross-sectional areas of five muscle groups from NE rats administered with CNPP

由图2可知，自由活动组中饲喂CNPP大鼠的5 个肌群横截面积增长量均随着时间的延长而显著增加（P＜0.05）。第50天时，自由活动组中饲喂高剂量或中剂量CNPP的大鼠的躯干及下肢根部肌群、背部肌群、肩胛内侧肌群和上肢左侧根部肌群的横截面积增长量显著大于空白组（P＜0.05），且其中饲喂中剂量CNPP的大鼠的各肌肉横截面积增长量较大，分别是空白组的1.19、1.16、1.24、1.93 倍。以上结果说明CNPP可以促进肌肉质量的增加，这可能是由于CNPP富含亮氨酸（8.3 g/100 g），且其通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号传导通路来促进蛋白质的合成[24]。首先由亮氨酸促进磷脂酰肌醇3激酶或蛋白激酶B，使mTOR蛋白上某些位点的苏氨酸和丝氨酸发生了磷酸化，进而活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin 1，mTORC1）。mTORC1的活化将促使真核翻译起始因子4E结合蛋白和核糖体S6激酶发生磷酸化，真核翻译起始因子4E结合蛋白磷酸化后释放了真核翻译起始因子4E，促进了mRNA翻译的起始，同时核糖体S6激酶发生磷酸化后促使核糖体蛋白S6磷酸化，促进了mRNA翻译，从而调节肌肉蛋白质的合成[25]。

2.3 饲喂不同剂量CNPP与乳清蛋白的大鼠肌群横截面积的比较

由图3A可知，在第50天时，自由活动组中饲喂高剂量或中剂量CNPP的大鼠的背部肌群、腰椎周围肌群、上肢左侧根部肌群的横截面积增长量显著大于乳清蛋白组（P＜0.05），其中饲喂低剂量CNPP的大鼠躯干及下肢根部肌群的横截面积增长量与乳清蛋白相比增加了3.54 cm2。由图3B可知，在第50天时，抗阻力运动组中CNPP各剂量组大鼠的躯干及下肢根部肌群、腰椎周围肌群、背部肌群以及上肢左侧根部肌群的横截面积的增长量显著大于乳清蛋白组（P＜0.05），其中饲喂低剂量CNPP的大鼠躯干及下肢根部肌群的横截面积增长量较高，与乳清蛋白组相比增加了3.47 cm2。以上结果说明饲喂CNPP的自由活动组和抗阻力运动组大鼠中大部分肌群的横截面积增长量显著大于乳清蛋白组，因此可以认为CNPP相对于乳清蛋白更易促进肌肉质量的增加。其他研究结果也表明，除了乳清蛋白之外的其他蛋白质具有较好的同乳清蛋白相似的促肌肉质量增长的效果。Joy等[10]研究表明，分别给健康男性补充含有8.0 g/100 g亮氨酸的大米蛋白与富含11.5 g/100 g亮氨酸的乳清蛋白8 周后，两组青年男性的瘦体质量和肌肉质量增加无显著差异。Urbina等[26]分别给老年女性每日补充24 g酪蛋白和乳清蛋白，8 周后发现，补充酪蛋白和乳清蛋白组的脂肪减少量和瘦体质量增加量无显著差异。Babault等[27]给老年男性补充含9.05%（质量分数，下同）亮氨酸的酪蛋白和12%亮氨酸的牛奶，10 周后发现两组老年男性的右股外侧肌厚度增加量无显著差异。然而也有一些研究得到相反的结果，认为乳清蛋白是促进肌肉质量增加最有效的膳食蛋白，Norton等[8]探讨补充乳清蛋白、大豆蛋白和小麦蛋白14 周对成年大鼠肌肉蛋白合成的影响发现，含有10.9%亮氨酸的乳清蛋白更有效地刺激肌肉蛋白的合成。Tang等[9]发现补充含有11.5%亮氨酸的乳清蛋白，青年男性的肌肉蛋白合成率显著高于补充含有质量分数9.0%亮氨酸的酪蛋白。

图3 第50天时饲喂CNPP与乳清蛋白大鼠肌群横截面积的增长量Fig.3 Increases in cross-sectional areas of the muscle groups in rats administered with CNPP or lactalbumin for 50 days

2.4 自由活动与抗阻力运动对饲喂同剂量CNPP大鼠肌群横截面积的影响

图4 第50天时抗阻力运动组中饲喂CNPP大鼠的肌群横截面积增长量与相同剂量的自由活动组的比较Fig.4 Increase in cross-sectional areas of the muscle groups in RE and NE rats administered with CNPP for 50 days

由图4发现，在50 d时抗阻力运动组饲喂高剂量CNPP的大鼠的躯干及下肢根部肌群、腰椎周围肌群的横截面积显著大于自由活动组同剂量肌群横截面积增长量（P＜0.05），抗阻力运动组饲喂低剂量和中剂量CNPP的大鼠的上肢左侧根部肌群的横截面积增长量显著大于自由活动组同剂量肌群横截面积增长量（P＜0.05），且饲喂高剂量CNPP的大鼠躯干及下肢根部肌群和腰椎周围肌群与饲喂低剂量CNPP的大鼠的上肢左侧根部肌群的横截面积增长量较大，与自由活动组相同剂量肌群的横截面积增长量相比，分别增加了1.27、0.45、0.17 cm2，综合结果发现运动可以促进大鼠肌肉质量的增加。运动之所以促进肌肉蛋白的合成，是因为抗阻力运动可以促进肌卫星细胞含量增加或抑制肌卫星细胞含量减少，从而抑制肌肉质量的减少，延缓肌肉衰减[28]。又根据抗阻力运动组饲喂CNPP的大鼠的肌群横截面积增长量大于自由活动组，推断CNPP与抗阻力运动具有协同作用，可更好地促进肌肉质量的增加。一些研究也表明，在补充丰富蛋白质的条件下进行抗阻力运动可以促进肌肉蛋白的平衡。例如，Tipton等[29]发现，补充含8.5%（质量分数，下同）亮氨酸的酪蛋白或含11.5%亮氨酸的乳清蛋白，与腿部伸展运动和举重相结合，可以促进健康青年男性或女性肌肉蛋白的合成。Anthony等[30]通过给大鼠每天饲喂含8.2%亮氨酸的大豆蛋白或10.2%亮氨酸的乳清蛋白，且每天对其进行跑步机训练，8 周后发现大鼠肌肉蛋白合成率分别增加8.2%或8.3%。综上可知，膳食蛋白质协同抗阻力运动（抗阻力运动方式包括：哑铃提踵、深蹲起、平板支撑、爬楼梯等）是促进肌肉质量增加或抑制肌肉衰减的有效方法。

3 结 论

在自由活动条件下富含亮氨酸的CNPP可以刺激大鼠5 个肌群横截面积增长量增加，且CNPP协同抗阻力运动更易促进大鼠肌肉质量增加，本研究不仅为寻找一个新的抑制或改善肌肉衰减的食用肽提供参考，同时为拓宽CNPP的用途提供依据，CNPP无论是在经济还是应用方面都有良好的发展前景。