同型半胱氨酸和乳腺癌相关基因在乳腺癌诊断中的应用*

李 强，邓 君（.成都航天医院检验科，四川成都60000；2.四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都60000）

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，对其易感基因的研究越来越受到人们重视，目前发现了多种基因表达异常与乳腺癌的发生、发展和预后有关，如人乳房珠蛋白（hMAM）基因[1]、myc基因[2]、HER⁃2 基因[3]和乳腺癌易感基因⁃1（BRCA⁃1）[4]等。近年来，有文献报道，同型半胱氨酸（Hcy）与乳腺癌的发生、发展有一定的相关性，是晚期乳腺癌独立危险因子[5⁃7]。但Hcy与乳腺癌相关基因联合检测在诊断中的应用研究尚少见。本研究采用荧光定量聚合酶链反应（FQ⁃PCR）法，检测乳腺癌患者外周血中hMAM、BRCA⁃1和myc基因表达量，同时采用循环酶法检测Hcy水平，探讨联合检测对乳腺癌诊断应用价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2014年6月至2016年6月成都航天医院门诊和住院乳腺疾病患者165例，按疾病严重程度分为良性乳腺病组（58例）和乳腺癌组（107例）。良性乳腺病组：年龄18～67岁；脂肪瘤27例，纤维瘤31例。乳腺癌组：年龄25～79岁；浸润性导管癌40例，乳腺单纯癌38例，不典型髓样癌8例，黏液癌21例；临床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期13例。所有患者经明确病理学诊断确诊。同时选取健康体检女性40例作为对照组，年龄20～71岁。3组年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.1.2 试剂和仪器 Hcy检测采用奥林巴斯680全自动生化分析仪，FQ⁃PCR Light Cycle荧光实时定量PCR仪购自瑞士Roche公司，FQ⁃PCR、反转录和内对照试剂盒均购自迈克生物技术有限公司。在7700序列检测分析仪上测定标准品和hMAM、myc和BRCA⁃1和GAPDH含量。引物和探针由华美生物工程公司合成。

1.2 方法 取静脉晨血5 mL，1 mg/mL乙二胺四乙酸抗凝，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。利用Trizol液提取总RNA，进行凝胶电泳鉴定。采用AMV反转录酶体系对提取的总RNA进行RT⁃PCR，42℃55 min。FQ⁃PCR 引物各 400 nmol/L，cDNA 5 μL，TaqDNA聚合酶 1.25 U，探针 150 nmol/L，10×缓冲液 5 μL，脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸和脱氧胞嘧啶核苷三磷酸各 200 μmol/L，尿嘧啶脱氧核苷三磷酸 400 μmol/L，二氯化镁5 mmol/L，尿嘧啶N⁃糖基化酶0.5 U。反应条件：50℃ 120 s，95℃10 min；再 94℃ 30 s，66 ℃ 60 s，42个循环。应用2⁃ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量，健康人组基因相对表达量为 1.011±0.083，以 2⁃ΔΔCt＞2 判断为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行处理。计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组Hcy水平和hMAM、BRCA⁃1和myc基因检测结果比较 良性乳腺病组Hcy水平和hMAM、BRCA⁃1、myc基因表达与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；乳腺癌组BRCA⁃1基因表达显著低于对照组和良性乳腺病组，而Hcy水平和hMAM、myc基因表达均显著高于对照组和良性乳腺病组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 3组Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因检测结果比较（±s）

表1 3组Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因检测结果比较（±s）

注：与对照组比较，aP＞0.05；与乳腺癌组比较，bP＜0.05

组别对照组良性乳腺病组乳腺癌组Hcy（μmol/L）9.22±2.54b 10.17±2.73ab 23.21±8.65 BRCA-1（×10-3）0.97±0.11b 0.94±0.15ab 0.35±0.04 myc（×10-3）1.45±0.13b 1.39±0.09ab 3.97±0.51 hMAM（×10-3）2.05±0.19b 1.95±0.06ab 6.88±0.74

2.2 Hcy和hMAM、BRCA⁃1、myc基因在乳腺癌临床分期中的检测结果比较 在乳腺癌组中，Ⅲ+Ⅳ期患者Hcy水平和hMAM、myc基因表达均显著高于Ⅰ+Ⅱ期，而BRCA⁃1基因表达显著低于Ⅰ+Ⅱ期，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌临床分期中的检测结果（±s）

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌临床分期中的检测结果（±s）

n分期I+II期Ⅲ+Ⅳ期6542 myc（×10-3）2.81±0.455.32±0.87 hMAM（×10-3）4.72±0.637.91±1.02 BRCA-1（×10-3）0.45±0.070.23±0.01 Hcy（μmol/L）19.36±5.0228.36±11.26

2.3 Hcy和 hMAM、BRCA⁃1、myc基因对乳腺癌诊断性能 Hcy和hMAM、BRCA⁃1、myc基因联合检测乳腺癌的灵敏度和阴性预测值均显著高于单个指标，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因对乳腺癌诊断性能

3 讨 论

BRCA⁃1、hMAM和myc均是近年来研究得较多的乳腺癌相关基因，其中BRCA⁃1是抑癌基因，也是乳腺癌最强易感基因之一，其变异携带者乳腺癌发病率高达60%～80%，欧美国家已将其列为遗传高风险人群筛查项目。BRCA⁃1在细胞生长、凋亡中起着关键作用，参与DNA损伤修复，当发生突变时，基因组稳定性遭到破坏，蛋白质表达功能下降，导致细胞恶变和增殖[8⁃9]。myc基因属于核蛋白类调控基因，编码细胞增殖、分化和凋亡等转录因子，在乳腺癌的扩增率约占30%，其异常表达与肿瘤发生、分期和远处转移等有关[10⁃11]，可辅助预测肿瘤复发和生存期。hMAM是1996年WATSON等发现并证实只在乳腺组织中表达的乳腺癌相关蛋白，具有极高组织特异性，其异常表达与乳腺癌的微转移和疗效密切相关[12⁃13]。

Hcy属于含硫氨基酸，高Hcy血症一直以来都是冠状动脉硬化的预测因子。近年来，有研究表明，Hcy可能还是乳腺癌的一个危险因素：一方面，大多数乳腺癌患者缺乏维生素B12和叶酸，引起蛋氨酸代谢障碍，导致Hcy水平持续性升高；另一方面，高Hcy诱导DNA损伤，造成遗传不稳定性，易导致乳腺癌，同时高Hcy可损伤内皮激活血小板，破坏凝血、抗凝血和纤溶系统，促进肿瘤细胞增殖[14⁃15]。目前，Hcy与乳腺癌相关基因的方法学比较文献及联合检测对乳腺癌临床诊断价值的报道较少见。

本研究采用循环酶法检测Hcy，FQ⁃PCR法测定BRCA⁃1、hMAM和myc基因表达量，结果显示，对照组Hcy水平和hMAM、BRCA⁃1、myc基因表达差异与良性乳腺病组均无显著差异；乳腺癌组的BRCA⁃1基因表达显著低于其他2组，而Hcy水平和hMAM、myc基因表达则显著高于其他2组；在乳腺癌患者中，随着临床分期的增加，Hcy水平和hMAM、myc基因表达递增，而BRCA⁃1基因表达递减；4个指标联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均显著高于单个指标。

综上所述，Hcy对乳腺癌的辅助诊断具有一定的临床意义，若能结合相关基因的检测，可明显提高对乳腺癌诊断的检出率。但是，基层医院可能缺乏基因检测的仪器，当Hcy水平异常升高时，在排除冠状动脉硬化等心血管疾病时，应考虑到乳腺癌的可能，可结合临床进一步确诊。