黑果小檗总花色苷的提取工艺及其急毒实验研究

迪娜·吐尔洪， 刘倩芸， 康莹莹， 李建光

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)为小檗科小檗属落叶灌木植物黑果小檗的成熟果实，多生长在我国新疆天山南北部[1]，主要化学成分包括生物碱、黄酮类、花色苷类化合物等，具有健胃消食、生津止渴、清热解毒的功效，民间长期作为泡茶饮用，具有降压的效果[2]。花色苷类化合物稳定性较差，温度、光照、氧气、金属离子和酶等因素可使其结构发生转变，其主要的提取方法有溶剂直接提取法、超临界CO2提取法、微波辅助提取法、回流提取法等[3-6]。本研究建立了以酶-超声波辅助提取花色苷的最佳提取工艺，采用急性毒性实验研究了黑果小檗总花色苷的毒性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器YP3002N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)，AS10200AD型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，RE5220型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，XMTD-4000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)，WV-754型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，TGL-16M型台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，SCIENTZ-10ND型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2试药XDA-7A大孔吸附树脂(陕西乐博生化科技有限公司，批号：2017-008)，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：R24N7F25521)，果胶酶(上海如吉生物科技发展有限公司，批号：170418)，试剂均为分析纯。

1.3药材黑果小檗2017年9月采自新疆乌鲁木齐市南山山区，经新疆维吾尔自治区中药民族药研究所贾晓光研究员鉴定为小檗科小檗属黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)的果实。

1.4实验动物健康SPF级KM小鼠60只，雌雄各半，体质量(18.0±2.0)g，购自新疆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(新)2016-0003，质量合格证号：65000700000904，实验动物自由摄食饮水。

2 方法

2.1黑果小檗总花色苷标准曲线的建立以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品溶液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得到标准曲线方程为A=42.094 6C+0.001 2，r=0.999 9，在浓度2.22～19.98 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2黑果小檗总花色苷的提取方法及提取率测定取黑果小檗果实粉末2.0 g，加入15倍体积醋酸钠-醋酸缓冲溶液，以果胶酶预先处理，在一定酶解条件(酶解pH、酶解温度、酶解时间、酶用量)下酶解，过滤，滤液备用，滤渣采用25倍70%乙醇(含0.3%盐酸)、60℃、60 kHz超声提取3次，每次20 min，提取液与滤液合并，10 000 r/min离心5 min后取上清液，采用pH示差法[7]测定总花色苷吸光度值A =(A515-A700)pH1.0-(A515-A700)pH4.5，黑果小檗总花色苷的提取率计算公式为：W(%)=(C×DF×V)/M×100%[式中：W为总花色苷提取率(%)；C为提取液质量浓度(mg/mL)；DF为溶液稀释倍数；V为溶液体积(mL)；M为药材质量(g)]。

2.3单因素考察采用“2.2项”下方法提取黑果小檗总花色苷，分别考察酶解pH(2、3、4、5、6)、酶解温度(30、40、50、60、70℃)、酶解时间(10、20、30、40、50 min)、酶用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)对黑果小檗总花色苷提取率的影响。

2.4正交实验设计在单因素考察的基础上，以总花色苷的转移率为考察指标，选择A(酶解pH)、B(酶解温度/℃)、C(酶用量/%)3个考察因素，每因素设计3水平，按L9(34)进行正交实验设计，见表1。

表1 黑果小檗总花色苷提取因素水平

2.5黑果小檗总花色苷提取物的制备按照最佳工艺条件对黑果小檗末进行提取，过大孔吸附树脂XDA-7A进行纯化，得到总花色苷提取物。

2.6急性毒性实验预实验时以最大给药浓度(0.8 g/mL)、给药体积(0.4 mL/10 g)灌胃1次，进行剂量范围的探索。正式实验取昆明小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分别为空白组(蒸馏水，0.4 mL/10 g)，16.000、12.800、10.240、8.192、6.554 g/kg剂量组(总花色苷提取物，0.4 mL/10 g)，每组10只。灌胃1 h后恢复进食，正常饲养，连续观察14 d。若有小鼠死亡立刻进行尸检，记录小鼠死亡时间及数量。灌胃前和灌胃后第14 d 2个时间点，对各组小鼠进行称重，观察小鼠体质量变化。

3 结果

3.1单因素考察

3.1.1 酶解pH值的选择 当pH为3时，在果胶酶的催化作用下，总花色苷的提取率为0.97 %，随着pH的增加，总花色苷的提取率降低，确定最佳酶解pH值为3，见图1。

图1 酶解pH值对提取率的影响

3.1.2 酶解温度的选择 50℃时酶的活性最高，总花色苷的提取率为1.19 %，确定最佳酶解温度为50℃，见图2。

图2 酶解温度对提取率的影响

3.1.3 酶解时间的选择 当果胶酶处理30 min，总花色苷的提取率为1.26 %，考虑到节时省能,确定最佳酶解时间为30 min,见图3。

3.1.4 酶用量的选择 总花色苷提取率随酶添加量的增加呈先上升后下降的趋势，当酶用量为2%，总花色苷的提取率为1.35%，确定最佳酶解温度为50℃，见图4。

图3 酶解时间对提取率的影响

图4 酶用量对提取率的影响

3.2正交实验结果各因素对黑果小檗总花色苷提取率影响的程度大小依次为：B>A>C。对各因素进行方差分析，因素A和B对黑果小檗总花色苷提取率的影响具有显著性，综合考虑优选出最佳条件为: A3B2C1，即酶解pH为4，酶解温度为50℃，酶用量为1.5%，见表2、3。

表2 黑果小檗总花色苷提取正交实验结果

表3 方差分析结果

3.3工艺验证实验按照最佳工艺条件进行提取，平行3次，黑果小檗总花色苷平均提取率为1.45%，RSD=1.5%，表明工艺重现性较好。

3.4急性毒性实验结果小鼠死亡立即解剖，肉眼未见内脏异常。经Bliss法计算黑果小檗总花色苷提取物对小鼠的LD50为10.929 g/kg，回归方程Y=-4.542 8+9.188 2 log(X)，LD50( Feiller校正)95%可信限=9.679～12.431 g/kg，LD50=7.237 1 g/kg，LD95=16.505 g/kg。与小鼠灌胃前初始体质量比较，灌胃14 d后小鼠体质量变化差异无统计学意义(P<0.05)，见表4、5。

表4 黑果小檗总花色苷提取物对小鼠的急性毒性结果

表5 总花色苷提取物对小鼠体质量变化的影响

4 讨论

花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成[9]，能够以完整的糖苷形式进入体内，具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗凋亡[12]等多种活性作用。近年来国内外学者对花色苷的提取方法研究较多，如通过发酵[13]、热超声[14]、加压液体萃取[15]等方法对花色苷进行提取，其中酶-超声波辅助法对花色苷的制备具有重要意义，可较温和的将细胞壁分解，促使花色苷的溶出，且提取时间短，提取效率高，但目前对于花色苷毒性方面的研究还不够成熟。本实验对黑果小檗总花色苷提取物进行了急性毒性评价，确定了LD50及安全用药剂量范围，为后续实验剂量的选择提供理论依据。