当归四逆汤对大鼠DPN抑制作用及AGEs/RAGE的调节

周晓晶 李 欣 柳烨惠 姜丽娟 刘 红 程思宇 邢日新 明容美 张文风

(长春中医药大学，吉林 长春 130017)

糖尿病周围神经病变(DPN)是一种进行性神经功能障碍，临床表现是远端周围神经对称性退化，间歇性持久肢体疼痛和丧失感觉〔1〕，可发生溃疡甚至导致截肢〔2〕，严重影响患者生活质量。临床研究已发现当归四逆汤能有效改善DPN患者主观神经症状，改善膝、跟腱反射及神经传导速度〔3〕，但其作用机制还需进一步探讨。现已明确，糖尿病时过高的血糖可转化为糖基化终末产物(AGEs)积聚于周围神经组织，当与AGEs受体(RAGE)结合后可启动下游信号通路干扰正常神经元，进而造成神经损伤〔4，5〕。本研究以AGEs/RAGE为靶点，研究当归四逆汤抑制DPN作用机制，为临床上DPN防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物与模型建立 雄性Wistar大鼠40只，体重(240±20)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(吉)2016-0003。大鼠随机分笼饲养于无特殊病原菌(SPF)条件下。喂养1 w、禁食12 h，于左下腹腔内注射链脲佐菌素(STZ，50 mg/kg)，72 h后尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠为造模。

1.2分组及给药 造模3 d后将造模成功的大鼠随机分为模型组、中药组、西药组，每组10只。另取10只健康大鼠设为正常组。模型组、正常组大鼠给予生理盐水灌胃；中药组大鼠给予熬制的当归四逆汤(7.44 g·kg-1·d-1)灌胃，西药组给予氨基胍100 mg·kg-1·d-1灌胃，共干预8 w。每天称量体重及监测血糖。

1.3取材及检测指标

1.3.1检测坐骨神经传导速度 给药8 w后，各组大鼠腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉，俯卧固定分离坐骨神经。检测坐骨神经传导速度：利用Medlab生物信号采集处理系统测定坐骨神经运动神经传导速度(MCV)和感觉神经传导速度(SCV)。刺激点位于坐骨结下，记录电极位于离刺激点2 cm处，刺激量从较小开始，逐渐增强到超强刺激。神经传导速度以复合动作电位出现的潜伏期与复合动作电位传导的距离比值来表示。

1.3.2检测坐骨神经形态变化 给药8 w后，分离大鼠双侧坐骨神经，检测坐骨神经形态变化。病理形态检测：坐骨神经放入10%甲醛溶液中固定，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm，HE染色，进行光镜下病理形态学检测。

1.3.3分光光度法检测坐骨神经AGEs含量 将坐骨神经超声匀浆，匀浆液4℃放置40 min，低温10 000 r/min离心15 min，取沉淀用于测AGEs含量。

1.3.4荧光定量PCR法检测RAGE mRNA的表达 提取总RNA，逆转录生成cDNA，利用表1中的引物扩增Glo1、RAGE，以GADPH做内参，琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。利用2-△△CT值比较各目的基因的mRNA表达情况。△△CT=(△CT实验组-△CT对照组)，其中△CT=(CT目的基因-CT内参基因)。内参基因为GAPDH。

表1 PCR引物

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件，组间比较用单因素方差分析。

2 结 果

2.1当归四逆汤对各组体重和血糖的影响 给药8 w后，与正常组相比，其余各组体重明显减轻(P<0.01)，血糖均明显升高(P<0.01)；与模型组及西药组相比，中药组体重增加、血糖明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组体重及血糖水平比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组及西药组比较：2)P<0.05

2.2当归四逆汤对坐骨神经传导速度的影响 给药8 w后，与模型组相比，各组坐骨神经MCV和SCV都明显升高(P<0.01)，说明当归四逆汤和弥可保都能提高糖尿病大鼠神经传导速度。西药组的神经传导速度与正常组差异有统计学意义(P<0.05)，而中药组与正常组差异无统计学意义(P>0.05)，说明虽然当归四逆汤与弥可保都能提高神经传导速度，但是当归四逆汤的效果更好，神经传导速度接近于正常水平。见表3。

表3 各组大鼠坐骨神经传导速度

与模型组比较：1)P<0.01；与正常组比较：2)P<0.05

2.3当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经病理形态的影响 给药8 w后，正常组坐骨神经纵切表现为有髓神经纤维排列紧密，髓鞘组织正常，雪旺细胞散在髓鞘边缘；横切髓鞘内轴突清晰可见。模型组坐骨神经纵切表现为神经纤维肿胀，鞘细胞减少；横切表现为神经外膜毛细血管扩张充血，炎细胞浸润，部分轴突消失。西药组坐骨神经出现部分神经纤维肿胀，鞘细胞数目减少，大部分髓鞘溶解。中药组坐骨神经中可见到少数正常髓鞘，鞘细胞数目增多，髓鞘中可见正常轴突。说明当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经形态具有明显保护作用。见图1。

图1 各组坐骨神经病理形态(×40，HE)

2.4当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经中AGEs水平的影响 给药8 w后，模型组的AGEs含量(173.42±14.87)明显高于正常组(70.21±9.26，P<0.01)；中药组与模型组相比，坐骨神经中的AGEs水平明显降低(124.65±14.16，P<0.05)。说明当归四逆汤能降低糖尿病大鼠坐骨神经内AGEs含量。

2.5当归四逆汤对DPN大鼠坐骨神经中RAGE mRNA水平影响 给药8 w后，与正常组(10.21±1.62)相比，模型组大鼠坐骨神经中的RAGE水平(30.36±1.87)明显升高(P<0.01)；与模型组相比，中药组坐骨神经中RAGE表达明显降低(15.56±2.61，P<0.05)，见图2。说明当归四逆汤能降低RAGE mRNA表达。

图2 各组坐骨神经内RAGE mRNA的表达水平

3 讨 论

尽管DPN发病机制还有待探讨，但已明确糖尿病时过高血糖产生的AGEs与RAGE结合启动的下游信号通路起着关键作用〔6〕。因此，降低AGEs及RAGE含量，将会切断后续的通路进而抑制DPN。

本研究发现当归四逆汤能提高糖尿病大鼠的坐骨神经传导速度，改善坐骨神经的形态结构，说明当归四逆汤能对DPN具有明显的抑制作用。此外，糖尿病大鼠坐骨神经中AGEs和RAGE含量明显升高，应用当归四逆汤后坐骨神经内AGEs含量明显降低，其受体RAGE mRNA的表达也明显下调，说明当归四逆汤减少了AGEs的生成和RAGE的表达。 因此，当归四逆汤对DPN的抑制作用可能是通过调节AGEs/RAGE轴实现的，这不仅阐释了当归四逆汤治疗DPN的机制，也为DPN的进一步防治提供了新思路。