DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4构建及免疫BALB/c鼠的效果

张 福 王 楠 姚 敏 何金婷 邵延坤 邢晓娜 徐忠信

(吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130000)

β淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集在阿尔茨海默病(AD)的起病及进展中起到核心作用〔1〕。免疫治疗可能是最有希望阻止和清除Aβ聚集的方法之一。Aβ42肽免疫AD转基因鼠能够产生高滴度抗Aβ抗体，减少鼠脑内Aβ沉积，并能改善鼠认知功能〔2〕。Aβ疫苗曾因6%的病人出现无菌性脑膜脑炎而被迫停止〔3〕，后认为与抗体无关〔4〕。本研究拟构建DNA疫苗p(Aβ3～10)10-m白细胞介素(IL)-4，并进一步探讨其作为AD疫苗的安全性及免疫效果。

1 材料和方法

1.1实验动物 8周龄BALB/c雄性小鼠18只、10月龄淀粉样前体蛋白(APP)/早老素(PS)1转基因鼠均购于中国医科大学实验动物部。

1.2主要试剂及仪器 质粒大量提取试剂盒(OMEGA)；抗Aβ抗体6E10(Signet)；Aβ42肽(AnaSpec)；即用型链霉亲和素生物素复合物(SABC)免疫组化试剂盒(武汉博士德)；ECM830电穿孔仪(美国BTX)等。

1.3p(Aβ3～10)10-mIL-4合成及提取 在GenBank中查找Aβ3～10的cDNA序列。人工合成重复10次的Aβ3～10的基因片段，在基因的5′端加入GCCACC kozak序列并引入HindⅢ(AAGCTT)的酶切位点，在基因3′端去掉TAG的终止密码子，加入连接GGGGS的碱基序列GGAGGCGGAGGCTCC，并引入BamHⅠ(GGATCC)的酶切位点。(Aβ3～10)10基因合成后装载到puc57载体。模板质粒pcDNA3.1(+)-mIL-4购于长沙赢润生物技术有限公司。双酶切(Aβ3～10)10基因片段和pcDNA3.1(+)-mIL-4质粒。将酶切后的(Aβ3～10)10基因片段和pcDNA3.1(+)-mIL-4质粒连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，进行质粒提取，测序和酶切鉴定正确。用质粒大量提取试剂盒进行大量提取。

1.4动物分组及免疫 随机分成3组，每组6只。p(Aβ3～10)10-mIL-4组免疫p(Aβ3～10)10-mIL-4，100 μg/次，pcDNA3.1(+)组免疫pcDNA3.1(+)，100 μg/次。两组注射质粒前腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mg/kg)，麻醉后在左后肢股四头肌肌肉注射质粒100 μg后用ECM830电穿孔仪进行电穿孔。Aβ42组免疫Aβ42肽50 μg/次，左后肢股四头肌肌肉注射。3组每3 w免疫1次，共5次。分别在免疫前、第2次免疫开始每次免疫后7 d进行小鼠眼眶后静脉丛取血。

1.5血清中抗Aβ抗体及分型检测 抗原包被96孔板。每孔加入100 μl 稀释的Aβ1～42(5 μg/ml)，4℃孵育过夜。洗板后加封闭缓冲液，室温下孵育。洗板后每孔加入50 μl稀释的血清和倍比稀释的标准抗体6E10。以1∶1 000稀释免疫前和免疫后的血清。洗板后加入二抗(IgG:1∶2 000； IgG1：1∶2 000； IgG2a：1∶1 000)。洗板后每孔中加入100 μl四甲基联苯胺(TMB)，室温孵育15 min。每孔中加入100 μl终止液(2N H2SO4)。读取450 nm处的OD值。

1.6抗血清对APP/PS1转基因鼠脑Aβ斑的识别 10月龄APP/PS1转基因鼠脑组织在4%多聚甲醛中固定过夜，常规制备石蜡切片。切片常规脱蜡至水。灭活内源性酶。热修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液。滴加一抗6E10及 p(Aβ3～10)10-mIL-4组免疫前及最后一次免疫后血清。磷酸盐缓冲液(PBS)洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG。PBS洗后滴加试剂SABC。二氨基联苯胺(DAB)显色，脱水，透明，封片。显微镜观察。

1.7统计方法 采用统计软件SPSS12.0进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1重组质粒p(Aβ3～10)10-mIL-4的构建 目的基因(Aβ3～10)10片段成功合成并克隆入pcDNA3.1(+)-mIL-4质粒中，构建重组质粒p(Aβ3～10)10-mIL-4：HindⅢ-kozak序列-(Aβ3～10)10-GGGGS连接-BamHI-IL-4-EcoRI。经酶切及测序证实质粒构建正确。

2.2免疫后血清抗体及分型测定 从第2次免疫开始Aβ42组及p(Aβ3～10)10-mIL-4组产生抗Aβ抗体，随着免疫次数增多抗体滴度逐渐增加，第5次免疫后两组均产生了高滴度的抗Aβ抗体，而Aβ42组抗体滴度显著高于p(Aβ3～10)10-mIL-4组(P<0.05)，pcDNA3.1(+)质粒组未产生抗Aβ抗体(表1)。p(Aβ3～10)10-mIL-4组免疫后产生的抗体以IgG1〔(26.72±2.43)μg/ml〕为主，IgG2a〔(2.86±0.80)μg/ml〕少量。Aβ42组产生的抗体IgG1〔(32.93±4.48)μg/ml)〕和IgG2a〔(28.5±3.91)μg/ml〕相差不多。p(Aβ3～10)10-mIL-4组IgG1/IgG2a比值(9.93±2.49)约是Aβ42组(1.19±0.33)的8倍。

2.3免疫后的抗血清与APP/PS1转基因鼠的老年斑相结合 经免疫组织化学染色证实重组质粒p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后产生的抗血清能与10月龄的APP/PS1转基因鼠脑内的老年斑相结合。抗Aβ抗体6E10作为阳性对照，而阴性对照，免疫之前的血清则未染出老年斑(图1)。说明p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后产生的抗体为抗Aβ抗体。

表1 3组免疫前后抗体滴度

与Aβ42组比较：1)P<0.05

图1 免疫后抗血清与APP/PS1转基因鼠老年斑结合(×400)

3 讨 论

安全有效的AD疫苗不仅需要产生治疗作用的抗体水平，还需要避免T细胞介导的炎症反应。本研究选择Aβ3～10作为目的基因片段，已有研究证实Aβ1～15是诱导B细胞体液免疫的主要表位〔5〕，选择该片段将避免产生T细胞介导的炎症反应。同时，研究表明Aβ4～10与抗Aβ抗体的亲和性最大〔6〕，而且Aβ3～6(EFRH)能够影响Aβ原纤维的溶解度和解聚作用，Aβ3也是老年斑Aβ沉积的重要成分，缺少3号位氨基酸将会影响其与抗Aβ抗体的亲和性〔7〕。所以，本实验选用Aβ42N末端Aβ3～10片段为抗原且将Aβ3～10重复10次以增强其免疫原性。

本研究选择Th2型细胞因子IL-4作为佐剂。IL-4是由活化Th2细胞分泌产生的免疫调控因子，能增强B细胞免疫应答，是Th2细胞分化的最主要决定因素〔8〕。当Th2型细胞因子同某种疫苗共同使用时，随着细胞因子表达，会使抗原特异的免疫应答向体液免疫应答的方向发展。研究表明将编码抗原基因与IL-4基因以融合蛋白的形式在体内表达可以提高抗原的免疫原性〔9〕。为了进一步增强疫苗免疫原性，选用体内电穿孔的基因递送途径。体内电穿孔是一种新颖的、非病毒载体的基因递送途径，能够使目的基因进入细胞内的概率增加，从而提高表达效率，并能够在肌肉组织中较长时间表达〔10〕。电穿孔导致的轻微组织损伤还可以诱导产生炎性细胞因子和淋巴细胞浸润，从而提高抗原递呈，增强机体的免疫应答〔11〕。

研究表明，抗Aβ抗体可以通过血脑屏障进入脑内，黏附在Aβ沉积物上并激活了周围的小胶质细胞，从而减少鼠脑内的老年斑〔12〕。本研究中，DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c鼠后产生了较高滴度的抗Aβ抗体。虽然p(Aβ3～10)10-mIL-4组抗体滴度低于Aβ42组，但是其明显高于pcDNA3.1(+)组。作为AD疫苗，p(Aβ3～10)10-mIL-4产生了足够的抗Aβ抗体水平〔13〕，而且p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗经电穿孔递送后，将会在肌肉组织中长期表达。本研究中p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗产生的抗体主要为IgG1，Th2型的抗体清除Aβ沉积更有效，而且发生炎症反应的可能性降低〔14〕。在AD的免疫治疗中，诱导明显的Th2型的免疫反应比单纯产生高滴度的抗体水平更重要。疫苗免疫后诱导的免疫球蛋白IgG的亚型可以间接反映免疫反应是Th1型还是Th2型〔15〕。在BALB/c小鼠，Th2型免疫反应主要诱导产生IgG1抗体，通过产生IL-4、IL-5等细胞因子增强体液免疫反应；而Th1型免疫反应主要产生IgG2a抗体，产生干扰素(IFN)-γ、IL-2等细胞因子诱导细胞介导的炎症反应。本研究提示p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫后产生的免疫类型为Th2型，这样就降低了发生炎症反应副作用的可能性。本研究表明p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗产生的抗体具有明显的特异性，具备进入转基因鼠脑内，与老年斑相结合的能力。

总之，本实验成功构建了表达(Aβ3～10)10和mIL-4融合蛋白的DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4。用p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗免疫BALB/c小鼠后产生了较高滴度的抗Aβ抗体，而且产生了Th2型免疫反应。p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗具备了安全有效的AD疫苗的基本要求。将在随后的研究中进一步探讨p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗的有效性及安全性。