苯丙酮尿症的实验室诊断与防治措施

植瑞东 何夏怡 宁红珠

(广东省肇庆医学高等专科学校 526020)

苯丙酮尿症(phenylketonuria， PKU)是一种以智力发育不全为主要特征的常染色体隐性遗传病，由肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase， PAH)或四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)合成酶缺乏导致苯丙氨酸(phenylalanine， Phe)代谢异常所致。前者称为经典型PKU，后者则称为BH4缺乏症。PKU在我国的群体发病率约为1/11144[1]。1953年德国的Bickel首先报道了用低苯丙氨酸方法治疗PKU获得成功，1963年Guthrie开展了新生儿筛查法，1983年Woo等[2]首先发现了PAH基因，开启了PKU的基因诊断和产前诊断。PKU是可治性的遗传病，通过及时诊断并采取有效的防治措施，可使PKU患儿保持正常的生理和智力发育，对改善患者的临床症状、减轻患者的痛苦及患者家庭的精神和经济负担意义重大。

1 PKU的发病机制与临床表现

1.1 经典型PKU的发病机制与临床表现 经典型PKU是由于PAH基因突变导致肝脏PAH缺乏或活性降低所致。正常情况下，人体内的Phe主要通过PAH的催化作用而被转变成酪氨酸，继而生成黑色素。如果PAH缺乏或活性降低，可使Phe转化成酪氨酸的代谢受阻，造成Phe在血中过量积累。过量的Phe使旁路代谢活跃，进而生成大量的苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸等产物，这些旁路代谢产物可对神经系统产生不可逆的毒性作用，从而使患儿在出生3个月后逐渐表现出发育迟缓、智力缺陷、语言障碍、小脑畸形和癫痫等症状[3]。血中过量的Phe可由尿液和汗液排出，使患儿的毛发、皮肤和尿液均有特殊的鼠臭气味。同时，由于Phe不能正常转化成酪氨酸，减少了黑色素的合成，使患者的毛发和皮肤颜色变浅。经典型PKU的发病率占PKU的98%～99%，患者血中Phe浓度>20mg/dL，而正常人血中Phe的浓度<2mg/dL。

1.2 BH4缺乏症的发病机制与临床表现 BH4缺乏症又称非经典型PKU或恶性PKU，由PAH辅酶BH4缺乏所致。PAH主要存在于肝脏，它的作用需要辅助因子BH4， BH4缺乏可影响PAH的稳定性，从而使其活性降低，使Phe转化成酪氨酸的代谢受阻，导致血中Phe浓度升高，出现类似于经典型PKU的代谢异常。

另外，在正常情况下PAH催化Phe转化为酪氨酸时，BH4也转化为二氢生物蝶呤(BH2)，后者在BH2还原酶催化下还原生成BH4。因此BH2还原酶缺乏时也会引起BH4缺乏，而导致Phe不能转化为酪氨酸，致使Phe在体内积累。由于BH4也是酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的辅助因子，因此当BH4缺乏时，亦可影响酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的稳定性，从而使其活性降低，导致神经递质左旋多巴和5-羟色氨酸的生成受阻，进而影响脑内神经递质多巴胺和5-羟色胺的生成，致使患者出现严重的神经系统损害症状，其后果比经典型PKU更为严重，且预后更差。BH4缺乏症的发病率占PKU的1%～2%，其类型包括GTP环羟化酶(GTPCH)缺乏症、6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏症、二氢生物蝶啶还原酶(DHPR)缺乏症和蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCT)缺乏症等类型。患者除有经典型PKU的临床表现外，还有明显的神经系统症状，如躯干肌张力下降、四肢张力增高、不自主运动、震颤、顽固性惊厥发作等[4]。

2 苯丙酮尿症的实验室诊断

2.1 血液苯丙氨酸浓度检测 检测方法很多，主要介绍其中的三种。

2.1.1 Guthrie细菌抑制试验法 本法是筛查PKU的常规方法，其基本原理为枯草杆菌的生长需要Phe，当在培养基中加入与Phe结构相似的抑制剂(β-2-噻吩丙氨酸)时，枯草杆菌的生长便受到抑制。若在此培养基中加入Phe，抑制剂的抑制作用即被解除，枯草杆菌又可重新生长。根据此原理，将PKU患者的待测样本(滤纸血片)放于含有抑制剂的培养基上，样本中的Phe便渗透到培养基内，被抑制的枯草杆菌即可重新生长，便在样本的周围长出明显的菌环，菌环的大小与样本中的Phe含量成正比。通过比较菌环的大小，便可测定血中Phe的含量。

2.1.2 化学荧光检测法 化学荧光法是卫生部推荐的实验方法之一，其实验原理是利用Phe能与茚三酮试剂反应生成荧光复合物，再加入增强剂和稳定剂增强荧光后，利用荧光分光光度计测定荧光强度，即可测定新生儿血中的Phe含量，荧光强度与Phe含量成正比。

2.1.3 高效液相色谱法 不同待测物与高效液相色谱柱的固定相之间的分配系数、亲和力和吸附力不同，当它们随流动相进入色谱柱移动时会因其分配系数等因素不同而被分离，并按一定顺序离开固定相进入检测器内，通过检测器的检测分析便可定量测定待测物的浓度。高效液相色谱法除可单独测定新生儿血中的Phe含量外，还可同时测定样本中的酪氨酸(Tyr)浓度，临床上推荐应用高效液相色谱法测定血中的Phe和Tyr浓度，然后根据Phe与Tyr的比值来进行新生儿PKU的诊断筛查(Phe/Tyr值小于1.0时为正常，反之为PKU患者)，可有效提高PKU患儿的检出率。高效液相色谱法具有检测时间短、灵敏度高、特异性好等优点，是PKU筛查诊断和治疗监测的良好检测方法[5]。

除上述方法外，临床上用于测定Phe浓度的方法还有酶定量检测法(苯丙氨酸脱氢酶定量检测法、苯丙氨酸裂解酶定量检测法和苯丙氨酸脱氨酶定量检测法)、质谱检测法和高效毛细管电泳法等，不一一赘述。

2.2 尿液代谢物分析检测 主要有尿蝶呤图谱分析和检测尿中苯丙酮酸的化学显色法。

2.2.1 尿蝶呤图谱分析 应用高效液相层析法测定尿液中的新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)的含量，可用于各型PKU的鉴别诊断。典型PKU患儿尿中蝶呤总量增高，N/B比值正常；PTPS缺陷所致的BH4缺乏症患儿尿中新蝶呤明显增加，生物蝶呤下降，N/B比值增高；DHPR缺乏症的患儿尿中新蝶呤可正常或稍高，生物蝶呤明显增加，N/B比值降低；CTPCH缺乏症的患儿尿中新蝶呤、生物蝶呤均降低，N/B比值正常。

2.2.2 尿三氯化铁试验和2，4-二硝基苯肼试验 两者均是检测尿中苯丙酮酸的化学显色法，一般用于较大婴儿或儿童的筛查。其原理为将三氯化铁滴入尿液中，若出现绿色反应则为阳性，表明尿中苯丙酮酸浓度增高。同理，在尿液中滴入2，4-二硝基苯肼后出现黄色沉淀反应则为阳性。

2.3 基因诊断 PAH基因定位于12q23.2[6]，98%以上的PKU都是由于PAH基因突变导致肝脏PAH缺陷引起。截至2014年，PAH基因国际数据库(www.pahdb.mcgill.ca)收录了752种突变，在中国人群中发现的PAH基因突变有100余种[7]。应用现代分子生物学技术对这些突变基因进行系统检测与分析，是开展PKU基因诊断和产前诊断、降低PKU患儿出生率和提高人口素质的重要手段，对于近亲结婚、家庭成员中曾有过PKU患者或曾生育过PKU患者的夫妇来说尤其重要。

2.3.1 聚合酶链反应-短串联重复序列(PCR-STR)连锁分析 在PAH基因3号内含子中(距外显子3700bp处)有一顺序为(TCTA)n的四核苷酸短串联重复序列(STR)，此序列具有高度的多态性，PCR扩增后的长度为228～260bp，可用于PKU的家系连锁分析[8]。PCR-STR分析法是经典型PKU基因诊断和产前诊断的一种简便、有效的方法。

2.3.2 聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析 单链的DNA片断具有复杂的空间构象，当某一碱基发生改变时，便会由于链内碱基对或分子内的相互作用力改变而形成不同的构象，这种构象的变化将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们就会出现泳动速度的差异。通过电泳图谱的差异进行PAH基因分析，即可对胎儿或新生儿的PKU进行诊断。

2.3.3 多重等位基因特异性聚合酶链反应(MAS-PCR) 根据N/C引物和M/C引物的MAS-PCR结果，可直接判断被检基因位点是否发生突变。如果只有正常引物N/C的扩增，说明该基因位点没有发生突变；如果只有突变引物M/C扩增，则为基因突变纯合子；正常引物和突变引物均有扩增，则为基因突变杂合子。临床上可用这一检测方法进行PKU的诊断。

除此之外，临床上应用于PAH基因检测的方法还有聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析法、聚合酶链反应-温度梯度凝胶电泳(PCR-TGGE)分析法和基因芯片分析法等。

3 苯丙酮尿症的防治

3.1 苯丙酮尿症的防治原则 PKU是一种可以早期筛查和治疗的常染色体隐性遗传病，其防治原则为： ①开展PKU新生儿筛查，早发现，早治疗。PKU新生儿筛查可在婴儿出生后2周内进行，一旦确诊，应及早给予积极治疗。治疗的年龄愈小，预后愈好，其智力发育更接近正常人，而较晚治疗可造成不同程度的智力低下。②推荐应用低苯丙氨酸饮食疗法。由于Phe是人体内合成蛋白质的必需氨基酸，完全缺乏时亦可导致神经系统的损害，因此在低苯丙氨酸饮食治疗中需严格控制Phe的摄入量，一般保持血中Phe浓度在2～6mg/dL较为理想。低苯丙氨酸饮食控制至少持续到青春期以后。③女性患者应于孕前开始进行低Phe饮食至分娩，以免高苯丙氨酸血症影响胎儿发育。④避免亲近结婚。⑤高危家庭必须采用基因诊断技术对其胎儿进行产前诊断，以降低PKU患儿的出生率。

3.2 苯丙酮尿症的治疗措施 主要包括饮食控制和药物治疗。

3.2.1 低苯丙氨酸饮食控制 主要用于经典型PKU患儿的治疗。天然食物和母乳均含一定量的苯丙氨酸，因此一旦确诊，患者就应立即停止天然饮食，哺乳期婴儿应暂停母乳喂养，给予低苯丙氨酸奶方治疗，以保证患者正常的生长发育。低苯丙氨酸饮食可推荐使用国产低苯丙氨酸奶方华夏2号，治疗中按其治疗剂量服用，并于治疗第一周内每天采血测定Phe浓度，至治疗第4d左右使患儿血中Phe浓度降至10mg/dL以下。待血Phe浓度降到理想浓度(0～3岁，2～4mg/dL；3～9岁，3～6mg/dL；9～12岁，3～8mg/dL；12～16岁，3～10mg/dL；大于16岁，3～15mg/dL)时，可逐渐少量添加天然饮食，其中婴儿首选母乳，较大婴儿及儿童可添加牛奶、粥、面和蛋等辅食。添加食品应以低蛋白、低苯丙氨酸为原则，其食量、次数随血Phe浓度而定。为监控患儿的Phe浓度，务必于更换食谱后3d复查Phe浓度。

3.2.2 BH4、5-羟色胺和美多巴药物治疗 主要用于BH4缺乏症患儿的治疗。BH4缺乏症患儿采用低苯丙氨酸饮食治疗，虽能降低血Phe浓度，但不能改善因BH4缺乏导致脑内神经递质生成障碍而出现的神经系统损害症状，因此必须给予BH4、5-羟色胺和美多巴等神经递质前质，以维持脑和神经肌肉的正常发育。

低苯丙氨酸饮食疗法是目前治疗PKU较为有效的方法，但因低苯丙氨酸产品的味道较差，往往导致患者的依从性降低，同时影响患者的生活质量。因此当患者难以继续坚持本饮食疗法时，应采取其他的治疗方法，如高剂量蛋白质替代疗法、酶替代疗法、大分子中性氨基酸摄入法或基因疗法等继续治疗，以达到理想的治疗效果。