桐城风鸭产香真菌的筛选与鉴定

姚秀香，王 武,*，李沛军，周 颖，童红甘，张华锋，叶 键

（1.合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽 合肥 230001；2.安徽先知缘食品有限公司，安徽 桐城 231400）

桐城风鸭产于安徽桐城地区，它是由当地传统的手工工艺，在自然条件下，低温腌制、风干而成的一种传统腌腊肉制品。风鸭贮藏时间长，蜡香浓郁，回味悠长，常作为款待亲友的一道佳肴。国外对传统腌腊制品的风味研究主要集中在火腿、发酵香肠等产品[1-2]，而在鸭肉腌腊制品发酵、风味等方面研究几乎是空白。我国在风鸭风味方面研究主要侧重于脂肪降解、氧化和蛋白质的分解等复杂的化学反应[3]，而微生物对风鸭风味的贡献关注较少[4]。自然界中的微生物具有强大的酶体系和丰富的代谢产物，可能存在潜在的风味发酵剂。目前肉类工业发酵剂细菌关注较多，主要是乳酸菌和葡萄球菌。乳酸菌[5-7]作为发酵剂可以降低产品pH值和产生细菌素，有效抑制杂菌，其次乳酸菌代谢的乳酸能与醇类形成香味浓郁的酯类，而凝固酶阴性葡萄球菌[8-10]作为发酵剂能抑制生物胺，有效代替亚硝酸盐，提高产品安全性，并形成很好的发酵风味。此外，研究表明酵母和霉菌能够在制酒、酱油等产品中产生重要风味，利用酿酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉制作微生物饲料，有效提高畜禽产品品质、改善肉类风味。在酱猪蹄中加入米曲霉、黑曲霉，得到外观风味好、保质期长的产品[11-12]。一方面，酵母菌和霉菌真菌可能产生酯类化合物，赋予传统干香肠的水果香味[13]。另一方面，真菌在传统香肠中的潜在发酵作用尚未确定[14-15]。本研究从桐城风鸭中筛选产香真菌，分析产香菌株的挥发性代谢风味产物，以期为新型肉制品发酵剂的开发及桐城风鸭风味形成机制提供研究参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桐城风鸭由安徽先知缘食品有限公司提供。

Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式酵母基因组、DNA抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、孟加拉红培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；脑心浸液肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；马铃薯 家乐福超市。

1.2 仪器与设备

S C I O N S Q四极杆气相色谱-质谱（g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪美国布鲁克公司；SCIENTZ-09型无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6D型电泳仪 北京六一生物科技有限公司；MINI4-UV型实验室纯水机科尔顿中国有限公司；2720thermalcycler型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、3730XL型测序仪 美国应用生物系统公司；FR980型凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司；DYCP-31DN型DNA电泳槽、DYY-5型稳压电泳仪 北京六一仪器厂；CAR/PDMS固相微萃取针、57330U型固相微萃取手柄 美国Supelco公司；FINNPIPETTE F3移液器 美国Thermo Fisher公司；DB-5MS毛细管色谱柱 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 产香菌株感官筛选标准

产香菌株感官筛选标准在文献[16]方法的基础上，稍作修改和补充，如表1所示。

表1 产香菌株感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of aroma-producing fungi

1.3.2 产香菌株的分离纯化

参考GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[17]。将风干后的鸭腿置于超净工作台上，按照无菌操作要求，用无菌解剖刀去骨后剪碎，四分法称取25 g样品加入225 mL 0.85%无菌生理盐水置于无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打2 min，制成1∶10的样品匀液，备用。用1 mL微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL，注入9 mL稀释液的无菌试管中，振荡混匀，制成1∶100的样品匀液，依次制备10 倍系列稀释样品匀液。换用100 μL微量移液器移取适宜的3～4 个质量浓度梯度鸭肉菌悬液100 μL分别涂布于孟加拉红平板中，每组3 个平行，与此同时，吸取100 μL无菌生理盐水加入3 个无菌平板内作空白对照，30 ℃培养5 d。根据菌落的颜色、形态、光泽等特点挑选出不同的霉菌、酵母，转到新的平板上继续培养、连续平板划线，连续纯化3 代后，将纯化后的菌落纯培养物接种试管斜面，于-4 ℃保存备用。

1.3.3 挥发性风味代谢产物分析

考虑菌株在不同的培养体系下可能会产生不同的代谢风味，经优化改良后的脑心浸液肉汤培养基被作为肉模拟体系的理想培养基[18]，实验将纯化后的菌株分别接种于马铃薯葡萄糖培养基和模拟肉体系中，并将未接种菌株的马铃薯葡萄糖培养基和模拟肉体系作为对照组，培养5 d，移取3 mL置于聚四氟乙烯密封的样品瓶中，将75 μm CAR/PDMS萃取头安装入手柄后，插入聚四氟乙烯密封的10 mL样品瓶中，缓慢推出纤维头，使其暴露在样品上部的顶空中，并与样品保持一定距离，60 ℃水浴吸附40 min[19]，将萃取头插入GC进样口，250 ℃解吸2 min，推回纤维头，拔出萃取针头，进行GC分析，采用顶空固相微萃取结合GC-MS检测挥发性代谢风味产物。

1.3.4 GC-MS条件

GC条件：DB-5MS毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，1 µm）；进样口温度与接口温度均为250 ℃，程序升温：柱初温40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min上升至60 ℃；再以10 ℃/min上升至100 ℃；接着以18 ℃/min上升至240 ℃保持6 min，检测温度240 ℃。载气为He，流速0.3 mL/min；恒压35 kPa，不分流[19]。

MS条件：离子源温度200 ℃；电子电离离子源；电子能量70 eV；灯丝电流150 μA；质量扫描范围m/z 33～450[19]。

1.3.5 化合物定性

利用美国布鲁克GC-MS solution工作站与NIST 11 library数据库检索，匹配度达到800以上，确定其化合物。

1.3.6 分子学鉴定

基因组D N A提取按真菌和酵母提取试剂盒操作。P C R扩增霉菌I T S测序[20]，引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。酵母26S rDNA测序[21]，引物NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG，序列5’→3’。PCR体系：Template（基因组DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（Mg2+）2.5 μL；dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL；酶0.2 μL；F（10 μmol/L）0.5 μL；R（10 μmol/L）0.5 μL；加双蒸水至25 μL。PCR循环条件[22]：94 ℃保持4 min，预变性；94 ℃保持45 s，55 ℃保持45 s，72 ℃保持1 min，循环30次；72 ℃保持10 min，修复延伸；4 ℃∞终止反应。1×TAE缓冲溶液，1%琼脂糖电泳，5 μL PCR产物，150 V、100 mA、20 min电泳观察，PCR产物的测序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。将测序结果登录NCBI网站用BLAST程序进行序列比对，用软件MEGA6.0构建系统进化树。

1.4 数据处理

采用美国布鲁克GC-MS solution工作站自带软件对原始数据进行绘图并截图，PhotoShop CC（2017版）软件对图像进行组合和标注，MEGA 6.0软件构建生物系统进化树。

2 结果与分析

2.1 产香菌株的筛选

表2 产香酵母菌株的筛选Table 2 Screening of aroma-producing yeast Y1

采用孟加拉红培养基分离桐城风鸭中的酵母菌，根据酵母的菌落形态分离出3株气味良好的酵母，将不同的酵母纯化后转入PDA培养基中30 ℃培养5 d，每隔1 d进行感官评价，实验结果如表2所示，与未接种菌株的空白组进行香气比对，接种酵母Y1菌株的培养基产青草香、醇香，确定酵母Y1菌株代谢风味产物具有青草香、醇香类风味物质。

表3 产香霉菌菌株的筛选Table 3 Screening of aroma-producing mold M3

采用孟加拉红培养基对桐城风鸭中的霉菌进行分离，根据霉菌的菌落形态和感官评价，分离纯化出6株气味良好的霉菌，将纯化后的霉菌转入PDA培养基中30 ℃培养7 d，每隔1 d进行感官评价，结果如表3所示，与未接种菌株的空白组进行香气比对，接种霉菌M3菌株的培养基产酯香，初步确定霉菌M3菌株代谢风味产物具有酯香类风味物质。

2.2 产香菌株的形态学特征

图1 产香菌株M3（A）和产香菌株Y1（B）的形态图Fig. 1 Morphology of mold M3 (A) and yeast Y1 (B)

选用孟加拉红和PDA培养基筛选、分离桐城风鸭中产香真菌，得到1株产香酵母Y1和产香霉菌M3，由图1可知，产香菌株M3菌丝体发达，呈现白色绒毛状，可初步确定为霉菌菌株。此外，实验发现M3菌株在常温和4 ℃低温下生长，能够在桐城风鸭的生产工艺中存活，生长周期在1周左右，且随着菌株的生长，酯香味越来越浓郁。产香菌株Y1在孟加拉红培养基内呈现玫红色，且菌落比细菌大，生长周期长，初步确定为酵母菌株，筛选过程中发现Y1菌株生长周期在5 d左右，培养过程中产生的青香味浓郁，综上，2株菌株均有作为发酵菌株的潜力。

2.3 产香菌株挥发性代谢产物分析

图2 产香酵母Y1在马铃薯葡萄糖培养体系下的挥发性代谢风味的GC-MS谱图Fig. 2 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in PDA medium identi fi ed by GC-MS

采用顶空固相微萃取技术结合GC-MS法测定产香酵母Y1在马铃薯葡萄糖培养体系下的挥发性代谢风味产物，结果如图2所示。与对照组相比，产香酵母Y1在马铃薯葡萄糖培养体系下，出现1-戊醇和苯乙醇两个吸收峰。孙宝国[23]研究表明1-戊醇香气阈值为4 000 μg/kg，带有面包香、酒香和果香；而苯乙醇具有新鲜面包香、清甜的玫瑰样花香，这种香味描述与实验结果一致，因此，产香酵母Y1在马铃薯葡萄糖培养体系下代谢产生的青香味来自于1-戊醇和苯乙醇2种风味物质的共同作用。

图3 产香酵母Y1在模拟肉体系下的挥发性代谢风味的GC-MS谱图Fig. 3 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in model meat system identified by GC-MS

考虑菌株在不同的培养体系下可能会产生不同的代谢风味，研究产香酵母Y1在模拟肉体系下的挥发性风味变化，采用顶空固相微萃取技术结合GC-MS法测定产香酵母Y1在模拟肉体系下的挥发性代谢风味产物，结果如图3所示。与对照组相比，产香酵母Y1在模拟肉体系下同样发现1-戊醇和苯乙醇2种风味物质吸收峰。实验过程中发现产香酵母Y1能有效改善模拟肉体系的风味，进一步推断这种风味的改变来自于1-戊醇和苯乙醇2种风味物质的共同作用。

通过对比马铃薯葡萄糖培养体系和模拟肉体系下挥发性代谢风味变化，进一步确定从桐城风鸭中筛选得到的产香酵母Y1能够产生1-戊醇和苯乙醇2种挥发性香气物质，1-戊醇被认为是蟹肉、兔肉、猪肉、鱼肉和风干鸭肉等多种肉制品中的挥发性风味化合物[24]，将戊醇与醛类、酮类共同制作液体香精添加到食品或肉味香精中，能有效地提升其脂肪香气[25]。苯乙醇具有玫瑰香，广泛应用于酿酒工业、化妆品和香料中[26]，余冰等[27]研究认为苯乙醇是发酵肉制品的主体风味成分，产香酵母Y1有作为生物生产1-戊醇、苯乙醇的开发潜力，这将对桐城风鸭风味形成机制的探究提供一定的理论依据。

图4 产香霉菌M3在马铃薯葡萄糖培养体系下的挥发性代谢风味的GC-MS谱图Fig. 4 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in PDA system identi fi ed by GC-MS

采用顶空固相微萃取技术结合GC-MS法测定产香霉菌M3在马铃薯葡萄糖培养体系下的挥发性代谢风味产物，结果如图4所示。与对照组相比，实验组接种产香霉菌M3后出现γ-癸内酯这种风味物质的吸收峰，且在马铃薯葡萄糖培养体系下接种产香霉菌M3后苯甲醛吸收峰明显高于对照组。孙宝国[23]研究表明苯甲醛具有甜的果香、坚果香和花香，而γ-癸内酯具有蜡香、果香、奶油香、桃子香和椰子香气，这与实验中观察的酯香味一致，因此，产香霉菌M3在马铃薯葡萄糖培养体系下产生的酯香味来自于苯甲醛吸收峰的增强和γ-癸内酯物质的出现。有研究表明[28]，苯甲醛赋予牛肉的坚果风味更易被消费者接受，此外，苯甲醛多次在鸭肉中检测出[29]。研究表明[30]苯甲醛在大蒜挥发性风味物质的1.35%，这被认为是肉制品中因生产工艺引入苯甲醛的一种途径；实验中发现产香霉菌M3同样能增强苯甲醛吸收峰的强度，相关研究表明霉菌存在多酚氧化酶[31]，这将可能是肉制品中苯甲醛吸收峰出现的另一种途径。综上，肉制品中的苯甲醛是来自加工工艺还是微生物的作用，以及产香霉菌M3如何增强苯甲醛吸收峰的形成机制，需要进一步论证，这将对桐城风鸭风味形成机制的探究提供一定的理论参考。

图5 产香霉菌M3在模拟肉体系下的挥发性代谢风味的GC-MS谱图Fig. 5 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in model meat system identified by GC-MS

为进一步探究产香霉菌M3在不同体系下的风味变化，采用顶空固相微萃取技术结合GC-MS法测定产香霉菌M3在模拟肉体系下的挥发性代谢风味产物，结果如图5所示。与对照组相比，产香霉菌M3在模拟肉体系下同样出现苯甲醛吸收峰的增强，并且出现γ-癸内酯新的吸收峰。实验过程中发现产香霉菌M3能有效改善模拟肉体系的风味，接种产香霉菌M3同样能够在肉模拟体系中产生酯香味，进一步确定这种风味的改变来自于苯甲醛和γ-癸内酯2种挥发性香气物质的共同作用。通过对比马铃薯葡萄糖培养体系和模拟肉体系下挥发性代谢风味变化，进一步确定从桐城风鸭中筛选得到的产香霉菌M3能够产生苯甲醛和γ-癸内酯2种挥发性香气物质，γ-癸内酯是在香料工业中普遍应用的一种风味物质[32]，它对整体肉香味有重要贡献，是调配炖煮鸡肉风味香精的重要原料[33]。这将对桐城风鸭风味形成机制的探究提供一定的理论依据。

2.4 分子学鉴定结果

图6 产香酵母Y1的26S rDNA（A）和产香霉菌M3的ITS（B）扩增片段凝胶电泳图Fig. 6 Electrophoresis profiles of amplified 26S rDNA from yeast Y1 (A)and amplified ITS from mold M3 (B)

分别对产香酵母Y1和产香霉菌M3进行26S rDNA和ITS扩增，产香酵母Y1的26S rDNA和产香霉菌M3的ITS扩增片段凝胶电泳结果如图6所示。产香酵母Y1和产香霉菌M3条带大约长度为600 bp。将PCR扩增产物回收测序，结果表明产香酵母Y1测序片段长度为590 bp，产香霉菌M3测序片段长度为599 bp。将测序后得到的基因序列置NCBI进行BLAST分析，结果表明产香酵母Y1与涎沫假丝酵母（Candida zeylanoides）序列同源性相似为99%，产香霉菌M3与烟管菌（Bjerkandera）序列同源性相似为100%。

图7 产香酵母Y1的26S rDNA相关菌株的系统发育树Fig. 7 Phylogenetic tree of yeast Y1 and related strains based on 26S rDNA gene sequence

图8 产香霉菌M3的ITS相关菌株的系统发育树Fig. 8 Phylogenetic tree of mold M3 strain and related strains based on ITS region sequence

使用Neighbor-Joining构建系统发育树，产香酵母Y1的26S rDNA和产香霉菌M3的ITS相关菌株的系统发育树结果如图7、8所示。产香酵母Y1和产香霉菌M3分别与涎沫假丝酵母和烟管菌在发育树上聚为一簇，具有较近的进化距离。综上，Y1酵母经26S rDNA核苷酸测序分析鉴定为涎沫假丝酵母菌株，M3霉菌经ITS核苷酸测序分析鉴定为烟管菌株。

3 结 论

选用孟加拉红和PDA培养基筛选、分离桐城风鸭中的产香真菌，得到1株产香酵母Y1和1株产香霉菌M3。Y1酵母经26S rDNA核苷酸测序分析鉴定为涎沫假丝酵母菌株，M3霉菌经ITS核苷酸测序分析鉴定为烟管菌株。采用顶空固相微萃取结合GC-MS技术，分别在马铃薯葡萄糖培养体系和模拟肉体系下进行这2株产香菌株的挥发性代谢风味产物分析，结果表明，该株涎沫假丝酵母在2种体系下产生的青香味可能来自于1-戊醇和苯乙醇2种物质的共同作用。而烟管菌在2种体系下产生的酯香味可能来自于苯甲醛和癸内酯2种风味物质的作用。此外，产香酵母Y1有作为生物生产1-戊醇、苯乙醇的开发潜力；产香霉菌M3有作为生物生产苯甲醛、γ-癸内酯的开发潜力。