酶解鸡血球制备抗氧化肽的工艺优化和分析鉴定

郑召君，张日俊*

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

随着自由基研究的不断深入，氧化应激和抗氧化保护作用的理论引起广泛关注。在需氧代谢过程中，氧气发生系列还原反应以调节信号转导和内环境稳态，同时伴随活性氧等自由基的形成[1-2]。正常状态下，活性氧等自由基产量与抗氧化防御系统处于动态平衡状态[3]。一旦平衡被打破，内源性防御系统无法继续有效地保护机体抵抗自由基的攻击，过量的活性氧等高活性分子则会导致蛋白质损伤、DNA突变、细胞膜磷脂氧化以及低密度脂蛋白改性，导致多种器官和系统的氧化性损伤，进而刺激产生危害机体健康的疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、白内障、神经退行性疾病、癌症等[4-6]。而补充外源性抗氧化剂，可帮助生物体维持自由基与抗氧化防御系统间的平衡，具有重要的生理意义。

抗氧化剂根据来源分为化学合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。考虑到化学合成抗氧化剂潜在的危害性，天然抗氧化剂因其安全性高且来源广泛而备受学者的青睐。近年来，从食物蛋白源的酶解物中提取活性肽已成为许多学者研究的热点[7-9]。而蛋白酶水解法也因具有反应温和、安全性高等优点，成为获取抗氧化肽等生物活性肽的有效手段。目前，学者们已利用蛋白酶水解食物蛋白制备出大量的抗氧化活性强且无副作用的肽段，可有效清除自由基并抑制脂质过氧化[10-13]。这些抗氧化肽通常由2～20 个氨基酸组成，且氨基酸的组成和序列对其发挥抗氧化活性具有决定性作用[14]。蛋白酶解受酶浓度、底物浓度、酶解温度、酶解时间和pH值等多个因素的影响，因此采用响应面分析法优化这些因素，对制备抗氧化活性强的酶解产物是非常必要的。

作为肉类加工行业的主要副产物，血液本身营养价值高，蛋白质质量分数高达20%左右，必需氨基酸（Lys、Leu等）含量高，其营养价值可与畜禽胴体中6%～7%的瘦肉相媲美，素有“液态肉”、“养血之玉”的美誉。而血球蛋白约占血液总蛋白的50%以上，营养价值高，可作为优质蛋白原料应用于食品和饲料中[15]。除了营养特性外，血球经酶解后的产物具有一定的生物学活性，如镇痛[16]、抗菌[17-18]、抗氧化[19]、ACE抑制[20-21]和缓激肽增强[22]等作用。然而当前用于制备生物活性肽的血球多是来源于牛血和猪血，而对家禽等其他动物的血球研究甚少[23]。因此，本研究以鸡血球为原料，筛选获得最佳蛋白酶酶解制备抗氧化活性高的酶解物，并通过响应面分析法对酶解条件进行优化，连续分离纯化以获得高活性的抗氧化组分，并对目标肽进行结构鉴定。以期为高效利用家禽血球提供实验依据和技术参考，也为家禽血球蛋白酶解物开发成抗氧化的功能性添加剂提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡血球由北京鸿顺养源生物科技有限公司提供，-20 ℃避光保存备用，使用前置于4 ℃过夜解冻。

酸性蛋白酶 北京东华强盛生物技术有限公司；中性蛋白酶G、碱性蛋白酶、风味蛋白酶G 南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶、胰酶、强阳离子填充树脂（Dowex 50W×8，氢型）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、菲啰嗪 美国Sigma-Aldrich公司；Protamex 诺维信酶制剂公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；iMark酶标仪 美国伯乐公司；离子交换层析柱（2.6 cm×60 cm）、BSZ-100自动部分收集器上海沪西分析仪器厂有限公司；LGF-10C型冷冻干燥机 北京军事医学科学院；ÄKTA explorer 10蛋白纯化仪 美国GE公司；nano高效液相色谱 美国Waters公司；Zorbax SB-C18预装柱 美国Agilent公司；Q Exactive高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher Scientifc公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺流程

鸡血球溶于0.1 mol/L HCl溶液（血球蛋白∶HCl溶液3∶2（g/mL））和去离子水中制备血球溶液，混合均匀后，置于40 ℃、200 r/min恒温振荡器中反应30 min。混合液冷却至室温，用85%乳酸溶液或4 mol/L NaOH溶液调节至预定pH值，加入蛋白酶，放入转速为200 r/min的恒温振荡器中进行酶解。反应结束后，90 ℃水浴15 min灭酶，冷却，在6 000×g、4 ℃条件下离心10 min得到活性强的上清液酶解物。

1.3.2 蛋白酶筛选

选用6 种蛋白酶，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶G、风味蛋白酶G、胰蛋白酶、胰酶和Protamex。在生产厂家推荐的最适pH值和温度基础上，考察不同酶用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%），酶解时间（1、2、3、4、5、6、7、8 h）对5%血球蛋白进行酶解反应。以酶解物DPPH自由基清除能力作为指标，筛选出适宜的蛋白酶。

1.3.3 单因素试验

以底物质量分数5%、pH 3.5、酶用量3%、酶解温度50 ℃、酶解时间4 h为基本条件，在其他条件不变的前提下，设置酶用量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%；酶解温度30、35、40、45、50、55、60、70 ℃；酶解时间1、2、2.5、3、4、5、6、7、8 h，以DPPH自由基清除能力作为衡量指标进行单因素试验。

1.3.4 响应面试验设计

利用JMP Pro 12.0软件，根据中心组合设计原理，选取酶用量（X1）、酶解温度（X2）、酶解时间（X3）这3 个影响酶解物抗氧化活性的主要因素作为响应面考察因素，以DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和还原力为响应值，设计3因素5水平试验优化酶解工艺，试验因素与水平见表1。

表1 响应面优化试验因素与水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface design

1.3.5 抗氧化活性检测

DPPH自由基清除能力测定[24]：将1.5 mL不同浓度的肽溶液与1.5 mL DPPH溶液（1.0 mmol/L）混合，室温避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。

超氧阴离子自由基清除能力测定[25]：将0.1 mL不同浓度的肽粉溶液加入2.8 mL Tris-HCl-EDTA（pH 8.2）缓冲液，25 ℃水浴保温10 min后加入0.1 mL 3.0 mmol/L邻苯三酚溶液，迅速混匀，每30 s于325 nm波长处测定吸光度，5 min结束。作吸光度随时间变化的回归方程，求其斜率。超氧阴离子自由基清除能力计算见下式：

式中：V对照为对照组邻苯三酚自氧化速率/（ΔA/min）；V样品为样品组邻苯三酚自氧化速率/（ΔA/min）。

还原力测定[26]：取1.0 mL样品与1.0 mL磷酸钠溶液（pH 6.6）及1.0 mL 1%铁氰化钾溶液混合，50 ℃孵化20 min。加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，5 000×g离心10 min。将2.0 mL上清液与2.0 mL去离子水、0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液混合，室温静置10 min，于700 nm波长处测定吸光度。

羟自由基清除能力测定：参考Zhang Tao等[27]的方法。

1.3.6 超滤处理

采用截留分子质量为3 kDa的50 mL超滤离心管对酶解物进行分级分离，获得两部分肽段（＞3 kDa）和（＜3 kDa），在5 000×g条件下低温离心15 min，冻干后分析其DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力与还原力。

1.3.7 阳离子交换色谱层析

称取DOWEX 50W×8（100～200 目，氢型）填充料溶入20 mmol/L醋酸铵溶液（pH 4.0），浸泡使其溶胀2 d，多次浮选去除未沉淀细颗粒后装柱（2.6 cm×60 cm），洗脱液平衡柱子至基线平稳。将超滤所得的抗氧化最强的组分溶解于相同的缓冲液以获得质量浓度为20 mg/mL的样品，0.22 µm滤膜过滤后上样，用0～1 mol/L甲酸铵溶液梯度洗脱并用自动部分收集器收集洗脱液，检测吸光度并混合相同洗脱峰的液体，冻干后分析抗氧化能力。

1.3.8 凝胶色谱层析

将1.3.7节所得的抗氧化最强的组分，配成20 mg/mL溶液，0.22 µm滤膜过滤后上样于Superdex Peptide HR 10/30色谱柱，用超纯水以1.0 mL/min的流速洗脱，检测吸光度收集各洗脱峰，冷冻干燥后测定各组分的抗氧化能力。

1.3.9 反相高效液相色谱层析

采用反相高效液相色谱进一步分离1.3.8节获得的活性较强的抗氧化组分，配成10 mg/mL溶液，过0.22 µm滤膜，于蛋白纯化仪进一步分离纯化。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18预装柱；流动相A为含0.1%三氟乙酸溶液，流动相B为含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；进样量为200 µL，流速为0.5 mL/min。上样前用流动相A平衡3 个柱体积，上样，再用流动相B进行梯度洗脱，收集活性峰，冻干并分析抗氧化活性。

1.3.10 结构鉴定

采用nano高效液相色谱在线连接电喷雾二级质谱鉴定纯化肽的氨基酸序列和分子质量。将目标肽段上样于液相色谱柱，用流动相B（含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液）进行梯度洗脱；经高效液相色谱分析后的样品穿过Thermo Q-Exactive高分辨质谱仪，在阳离子模式下（喷雾电压2 kV，毛细血管温度320 ℃）进行离子化（质谱检测由中国农业大学生物质谱实验室完成）。二级质谱肽序列分析借助Mascot Distiller 2.4 （Matrix Science，London，UK）和Swissprot数据库。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选结果

自由基清除剂可与DPPH中的单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度可用吸光度检测，因此DPPH被广泛应用于自由基清除剂的筛选[28-30]。由图1a可知，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性明显优于其他5 种酶。而且随着酶用量的逐渐增加，酸性蛋白酶水解物DPPH自由基清除能力在酶用量3%时达到最大值，为（92.95±0.17）%。由图1b可知，随着酶解时间的逐渐延长，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性维持相对稳定状态，其DPPH自由基清除能力均维持在90%以上。而其他5 种蛋白酶的酶解物DPPH自由基清除能力随着时间变化而上下波动。由此可见，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性最佳且成本低，可作为制备血球抗氧化肽的工具酶。酸性蛋白酶是由黑曲霉发酵提纯而成的内切性蛋白酶，安全性高且活力强，其酶解物多具有抗菌[31]、抗氧化[32]、ACE抑制[33]等活性。

图1 酶用量（a）和酶解时间（b）对酶解物清除DPPH自由基清除能力的影响Fig. 1 Effects of E/S ratio (a) and hydrolysis time (b) on the DPPH scavenging activity of hydrolysates using various proteases

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶用量对DPPH自由基清除能力的影响

图2 酶用量对酶解物DPPH自由基清除能力的影响Fig. 2 Effects of enzyme dosage on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由图2可知，随着酶用量的逐渐增加，DPPH自由基清除能力逐渐增强，当酶用量为2.5%～3%时达到最大值。这是因为在底物浓度一定的条件下，酶浓度较低，酶解反应速率快，DPPH自由基清除能力升高。而随着酶用量的逐渐加大，反应体系中的酸性蛋白酶已处于饱和状态，反应速率不再变化，酶解产物DPPH自由基清除能力逐渐趋于平稳。当酶用量为2.5%时，DPPH自由基清除能力高达92.30%，考虑到节约成本，选用酶用量2.5%作为下一步研究条件。

2.2.2 酶解温度对DPPH自由基清除能力的影响

图3 酶解温度对酶解物DPPH自由基清除能力的影响Fig. 3 Effects of hydrolysis temperature on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由图3可以看出，酶解物的DPPH自由基清除能力随酶解温度的升高而增强，在温度50 ℃时达到最大值；之后，酶解物DPPH自由基清除能力随温度的继续升高而逐渐降低。因此选用酶解温度50 ℃作为后续研究条件。

2.2.3 酶解时间对DPPH自由基清除能力的影响

图4 酶解时间对酶解物DPPH自由基清除能力的影响Fig. 4 Effects of hydrolysis time on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由图4可知，酶解时间1～3 h对酶解物DPPH自由基清除能力影响并不明显，此时其清除能力维持在92%左右。然而随着酶解时间的延长，其DPPH自由基清除能力总体呈下降趋势。究其原因可能是随时间的不断延长，酸性蛋白酶将具有抗氧化活性的长肽链切割水溶性小肽，使其不易与脂溶性的自由基结合，从而致使抗氧化能力降低[34]。考虑到酶解产物的稳定性问题，选择酶解时间2.5 h。

2.3 酸性蛋白酶酶解血球的响应面分析

2.3.1 响应面试验设计及结果

表2 响应面设计方案与结果Table 2 Program and experimental values for response surface analysis

表3 DPPH自由基清除能力（Y1）的试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model of DPPH scavenging activity

为获得高抗氧化活性的血球蛋白酶解物，采用响应面设计对水解条件（酶用量、酶解温度和酶解时间）进行优化，以期获得抗氧化最强的酶解物。以X1、X2、X3分别表示酶用量、酶解温度与酶解时间，以DPPH自由基清除能力（Y1）、超氧阴离子自由基清除能力（Y2）和还原力（Y3）为响应值，设计3因素5水平的二次回归方程拟合因素和响应值间的函数关系，见表2。根据试验结果建立多元二次回归方程：Y1=77.50-14.94X1+2.47X2-10.49X3-0.58X12-0.03X22+4.96X32+0.30X1X2-0.89X1X3-0.25X2X3；Y2=-292.2+69.70X1+7.88X2+42.70X3-15.09X12-0.095X22-8.74X32+0.31X1X2-3.54X1X3+0.18X2X3；Y3=4.67-1.58X1-0.026X2-0.15X3+0.11X12-0.000 62X22+0.15X32+0.033X1X2-0.23X1X3-0.000 47X2X3。

表4 超氧阴离子自由基清除能力（Y2）的试验结果方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model of superoxide anion scavenging activity

表5 还原力（Y3）的试验结果方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression model of reducing power

由表3～5可知，3 个模型的R2和调整R2均大于0.93，且P值均小于0.000 1，证明该试验方法是可靠的，各因素水平区间设计合理，因此可用模型替代真实试验点来模拟因素和响应值之间的关系。此外，X2（酶解温度）对3 个响应值均有极显著的线性影响（P＜0.01），且其二次项也可显著影响抗氧化效果（P＜0.05）。而X3（酶解时间）与3个因变量Y1、Y2和Y3

2.3.2 交互作用分析

图5 酶用量和酶解温度交互作用对酶解物抗氧化活性的影响Fig. 5 Three-dimensional response surface plots showing the interactive effects of various factors on the antioxidative activity of hydrolysates

采用JMP软件对酶用量和酶解温度交互作用进行模型分析，当酶解时间固定在中心值2.5 h时，酶用量和酶解温度对Y1、Y2和Y3影响的响应面分析图及等高线如图5所示。对于酶解物的DPPH自由基清除能力（Y1）而言，酶用量（X1）对其影响最显著，酶用量的增加会引起清除能力的下降。而且酶用量对酶解物的超氧阴离子自由基清除能力（Y2）的影响效果也很明显，酶用量在2%～2.5%范围内Y2达到最高值。而酶解温度在45～50 ℃时可获得较高的DPPH和超氧阴离子自由基清除能力，这是因为在该温度区时，部分蛋白在热作用下去折叠，内部疏水基团或质子供体残基暴露，而且此时蛋白酶活性最高，有利于酶解反应，对酶解产物发挥抗氧化活性有一定的促进作用。就还原力而言，高温高酶用量或低温低酶用量有助于提高酶解物的还原力。

2.3.3 最佳酶解工艺条件的验证结果

对回归模型进行数学分析，获得酸性蛋白酶酶解血球的最佳工艺参数为酶用量2%、酶解温度45 ℃、酶解时间3.0 h，这与表2中处理组18相同。比较而言，该条件下所获得的DPPH自由基清除能力和还原力明显优于其他处理组，因此确定酶用量2%、酶解温度45 ℃和酶解时间3.0 h为最佳工艺条件。该条件下，获得的酸性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除能力为（98.31±0.66）%，超氧阴离子自由基清除能力为（28.89±0.31）%，还原力为1.94±0.03。

2.4 抗氧化肽纯化结果

2.4.1 超滤各组分抗氧化性比较

表6 酸性蛋白酶酶解物超滤后两组分的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of two ultrafiltration fractions of antioxidant hydrolysate SH

采用截留分子质量为3 kDa的超滤膜对血球蛋白酸性蛋白酶酶解物进行初步分离纯化，收集得到两个组分：SH-I和SH-II。由表6可知，SH-I（＜3 kDa，4 mg/mL）清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基能力和还原力明显高于SH-II（P＜0.01，4 mg/mL）。虽然SH-I和SH-II清除羟自由基的能力在统计学意义上不显著，但SH-I的羟自由基清除能力数值上高于SH-II。加之目前报道的生物活性肽多是低于3 kDa的肽段，因此组分SH-I被多次收集冻干后继续下一步分离。

2.4.2 阳离子交换色谱层析

将SH-I上样于阳离子交换层析柱，经甲酸铵溶液梯度洗脱后获得4 组分（A～D），多次重复分离、收集组分冻干后测定各组分的DPPH自由基清除能力。由图6a1可以看出，所有分离组分中，组分B（2 mg/mL）具有最强的DPPH自由基清除能力，为（88.92±6.03）%。此外，研究还发现组分B具有最强还原力为0.96±0.02，因此对B组分进行下一步分离纯化。

2.4.3 凝胶色谱层析

Superdex Peptide HR 10/30凝胶色谱柱对B组分进行分离纯化，分成10 个不同的组分（a～j）见图6b1。所有组分被收集冻干后测定其抗氧化能力。结果表明，阳离子交换色谱层析获得的B组分经凝胶色谱分离后的j组分（0.1 mg/mL）的DPPH自由基清除能力最强，被应用于下一步的分离纯化。

2.4.4 反相高效液相色谱层析

将酸性蛋白酶酶解物经超滤、离子交换色谱层析、凝胶色谱层析后得到的组分j加入到Zorbax SB-C18的柱子进行高效液相色谱的进一步分离纯化，结果如图6c1所示。通过检测2 个组分的抗氧化活性发现，组分I（0.1 mg/mL）具有最强的DPPH自由基清除能力（（87.16±1.59）%）和还原力（0.21±0.01）。该组分再次上样于高效液相色谱检验纯度后，进行质谱分析。

图6 分离纯化SH-I制备抗氧化肽并鉴定其氨基酸序列Fig. 6 Purification and identification of antioxidant peptide SH-I

2.5 结构鉴定与分析

经分离纯化后的组分I采用高效液相色谱-串联电喷雾电离源质谱仪进行测序并借助软件对质谱结果进行分析。如图6d2所示，氨基酸序列为Met-Gly-Gln-Lys-Asp-Ser-Tyr-Val-Gly-Asp-Glu-Ala-Gln-Ser-Lys-Arg-Gly-Ile-Leu-Thr（MGQKDSYVGDEAQSKRGILT）。根据氨基酸序列预测该抗氧化肽的结构如图7所示。经肽库、抗菌肽库和美国化学文摘等检索，该肽段为首次发现的具有显著抗氧化活性的肽段。

该目标肽的分子质量为2 182.1 Da，与源自金枪鱼内脏蛋白酶解物的抗氧化肽（518.5 Da）、玉米抗氧化肽（782.3 Da）和脱脂花生粕抗氧化肽（325.5 Da）相比，其分子质量较大。但也有许多研究学者从食源蛋白中分离提取出2 kDa左右的抗氧化肽，如鳕鱼骨架中1 801 Da的抗氧化肽[13]、鸡蛋中1 754 Da抗氧化肽[30]、牛蛙肌肉中1 988 Da抗氧化肽[35]等。多数研究报道表明，分子质量在200～3 000 Da区间的肽段具有较强的抗氧化活性[25,36-37]。此外，该肽段中含有Met、Leu等疏水性氨基酸和非极性脂肪族氨基酸（Val），这些氨基酸对疏水性组分有很高的结合能力，有助于增强活性肽和自由基间的相互作用从而提高抗氧化能力[38-39]。也有研究报道称酸性氨基酸（Glu、Asp等）残基的存在有助于增强肽段的抗氧化能力[40]。此外，Tyr、Gly、Glu、Gln等氨基酸残基可提供质子以淬灭孤电子或自由基，这对肽抗氧化活性的体现具有重要影响[41]。总体而言，氨基酸数目、种类及组成对抗氧化肽发挥其活性具有至关重要的作用。

图7 纯化肽的预测结构示意图Fig. 7 Predicted structure of the purified peptide

3 结 论

本研究通过酶解鸡血球蛋白制备抗氧化肽并对其进行结构鉴定。6 种蛋白酶中，酸性蛋白酶水解获得的酶解物具有最高的DPPH自由基清除能力（＞80%）。采用响应面分析法优化酶解工艺，获得其最佳水解条件为酶用量2%、酶解温度45 ℃和酶解时间3.0 h，在此条件下获得酸性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除能力为（98.31±0.66）%，超氧阴离子自由基清除能力为（28.89±0.31）%，还原力为1.94±0.03。利用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到液相组分I，其在质量浓度为0.1 mg/mL时，DPPH自由基清除能力和还原力分别为（87.16±1.59）%和0.21±0.01。经质谱鉴定得到的目标肽氨基酸序列为MGQKDSYVGDEAQSKRGILT，分子质量为2 182.1 Da。为家禽血液蛋白资源的开发利用和精深加工提供实验依据和技术参考，也为家禽血球蛋白酶解物开发成抗氧化的功能性添加剂奠定理论基础。