microRNA在牙发育和萌出中作用的研究进展

刘苍维，张 雪，胡 月，郝新青，赵 欢，李 媛，闫广兴，周怡君，史 册，孙宏晨

(1.吉林大学口腔医院病理科,吉林 长春130021;2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春130021)

微小RNA(microRNA, miRNA)作为非编码RNA中的一种，自被发现以来就备受关注。已有研究[1]证实：miRNA可参与细胞的增殖、分化和器官发育等过程。miRNA通过与靶mRNA的3′非编码区(3′ untranslated region, 3′ UTR)互补配对，使得靶序列降解或是翻译受到抑制，从而在转录后水平调控基因的表达。此外，也有研究[2]显示miRNA可直接或间接激活基因表达。牙发育是一个上皮和间充质相互作用的复杂过程，其中涉及到很多信号通路和蛋白，miRNA可通过影响牙发育相关分子(信号分子和转录因子等)进而影响牙发育过程。此前国内已有综述[3]阐述miRNA对釉质和牙本质发育及进化的作用，但其对参与釉质及牙本质发育miRNA的介绍不够全面及完整，且近年来miRNA对牙发育的研究又有部分新进展。因此，本文就miRNA在牙发育各时期的表达、miRNA对牙本质和釉质形成及牙萌出的影响进行综述，为牙发育的生物学机制的研究提供新思路。

1 miRNA的形成和作用机制

miRNA是一段由19～25个核苷酸组成的单链非编码RNA，在转录后水平负向或正向调控基因的表达。miRNA合成在细胞核中开始，在RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的作用下，以miRNA基因序列为模板，先合成具有茎环结构的初级miRNA(primary miRNAs, pri-miRNAs)。在哺乳动物中，经RNase Ⅲ核酸内切酶Drosha作用打开茎环，变成前体miRNA(precursor miRNAs, pre-miRNAs)后出细胞核。进入细胞质后，pre-miRNA在另一种RNase Ⅲ核酸内切酶Dicer作用下，变成成熟的miRNA[1]。

miRNA负向调控基因表达的功能是通过RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex， RISC)来完成的。RISC的核心成分是AGO家族蛋白，miRNA与AGO结合后，形成miRNA效应复合物(miRNA-RISC)，发挥负向调控基因表达的作用[4]。miRNA通过5′端的长度为5～7个核心核苷酸的“种子序列(seed region)”与靶mRNA的3′ UTR实现特异性配对，从而在转录后水平减弱蛋白质的翻译或降低mRNA的稳定性[5-6]，而miRNA-RISC对靶mRNA的抑制方式是由miRNA与靶mRNA之间的配对程度决定的。大部分植物miRNA与靶mRNA高度配对，通过类似小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的作用方式，引起靶mRNA的切割或降解；但大部分动物miRNA与靶mRNA为不完全配对，需通过翻译抑制来减弱基因表达。

除负向调控基因的表达外，研究[2]表明：miRNA在不同种的细胞或同种细胞不同状态下具有直接或间接激活基因表达的能力，但其具体机制尚不十分明确。如miRNA-551b-AGO1复合体与RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ, RNA Pol Ⅱ)结合后，可促进STAT3募集转录因子TWIST1，并进一步激活其表达。因此研究人员提出可能是由AGO蛋白将miRNA转运至细胞核后，miRNA与启动子相结合，从而促进转录因子和RNA PolⅡ与启动子的结合，进而激活下游靶基因的表达[7]。

2 miRNA在牙发育中的作用

牙发育是外胚层来源的上皮和神经嵴来源的间充质相互作用的结果[8]。牙发育过程大致包括形态发生[9]、牙本质形成和釉质形成[10]。形态发生又包括起始期、蕾状期、帽状期和钟状期[11]。帽状期可见牙胚形态，牙胚由成釉器、牙乳头和牙囊三部分组成。成釉器由上皮分化而来，钟状期成釉器分为外釉上皮、星网状层、中间层和内釉上皮；牙乳头和牙囊由间充质细胞分化形成。钟状期晚期，靠近内釉上皮的牙乳头细胞开始分化为成牙本质细胞，成牙本质细胞分泌的牙本质基质蛋白矿化形成牙本质。随后，靠近牙本质的内釉上皮分化为成釉细胞，釉质形成开始。牙本质形成后，牙乳头即为牙髓。牙冠发育完成后，成釉器颈环处的内釉上皮和外釉上皮向根方延伸，形成位于牙乳头和牙囊之间只有2层上皮细胞组成的上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath, HERS)[12]。随着HERS向根部延长，临近HERS内层的牙乳头细胞在HERS分泌的细胞因子诱导下，分化为成牙本质细胞，形成根部牙本质。随后，HERS呈网状断裂，牙囊细胞穿过孔隙与新形成的牙本质接触，被诱导分化为成牙骨质细胞，形成牙骨质。此外，一部分HERS细胞也可分化为成牙骨质细胞，参与形成牙骨质[13]。与此同时，前成纤维细胞迁移至牙根和牙槽骨表面，分泌胶原纤维，参与形成牙周膜纤维。随着牙根的发育和伸长，牙逐渐萌出至口腔并建立正常的咬合关系，发挥咀嚼和发音等功能。

为了确定miRNA在牙发育中的重要作用，研究者[14]利用Cre-loxP系统敲除牙胚中的Dicer1基因，在小鼠体内采用K14-Cre条件性敲除胚胎外胚层细胞的Dicer1基因后，牙的形状和磨牙牙尖的形态发生了改变，成釉细胞的分化和釉质的形成也受到影响，这与Pitx2-Cre条件性敲除胚胎外胚层中Dicer1基因的研究[15]结果相似，表明上皮细胞中的miRNA在牙发育中起重要的作用。采用Wnt1-Cre敲除间充质中的Dicer1基因，表现为胚胎上颌牙形态异常，下颌牙发育停留在帽状期[16]。上与下颌牙比较，不同的发育异常表型说明存在其他机制调节miRNA的功能。上述研究表明：牙形态的正常发育需要miRNA，并且上皮和间充质中的miRNA对牙发育均有调节作用。

2.1 牙发育过程中miRNA的表达 牙发育过程中，无论是在外胚层还是间充质中均有特异的miRNA表达谱。分析小鼠胚胎15.5 d(embryonic day 15.5, E15.5)、出生后第0天(postnatal day 0, PN0)和出生后第5天(postnatal day 5, PN5)的下颌第一磨牙牙胚中miRNA表达的研究[17]结果显示在牙发育过程中miRNA表达是动态变化的。有31种miRNA只在出生前的发育过程中表达，这31种miRNA特异性地调节细胞的生长和分化。小鼠切牙唇侧颈环处的成釉细胞在不同的分化阶段miRNA表达谱也不同[18]。分析小型猪下颌磨牙牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状期早期和钟状期晚期中miRNA的表达谱[19]结果显示涉及到的miRNA达166种。体外诱导人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中，所鉴定的有12种miRNA表达上调，10种表达下调[20]。总之，在牙发育过程中miRNA表达谱十分复杂,贯穿了牙发育的整个过程。

2.2 miRNA参与调控牙本质的形成 牙本质是由成牙本质细胞分泌的牙本质基质矿化后形成的。成牙本质细胞由牙乳头细胞分化而来，这一分化过程主要受Wnt、Notch、转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)和音猥因子(sonic hedgehog, SHH)等信号的调控。这些信号通路在牙发育的不同时间点通过影响细胞的生物学行为(包括增殖、凋亡、细胞骨架重排、终末分化和细胞外基质的合成等)来调控牙发育。此外，成牙本质细胞分化过程中也受其他重要分子的调控，如Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix, OSX)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophophoprotein, DSPP)和同源盒转录因子3(distal-less homeobox 3, DLX3)等。miRNA通过调节上述信号通路和相关分子进而调控牙本质的形成。见表1。

表1 牙本质形成过程中相关miRNAs及其靶基因

DSPP是一种在牙发育过程中可以高特异性标志成牙本质细胞的牙本质基质蛋白。研究[21]表明:miR-32、miR-885-5p和miR-586在成牙本质细胞分化过程中可在转录后水平调节DSPP的表达，但具体机制尚不十分明确。在小鼠的成牙本质细胞和人牙髓细胞分化过程中，miR-665表达下调，导致miR-665与Dlx3 mRNA的3′ UTR结合减少，Dlx3 mRNA的降解减少，DLX水平升高，正性调控DSPP的表达[22]。

miR-34a可以抑制Notch和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路。因为Notch活化抑制细胞分化，所以当miR-34a抑制Notch信号通路后，可以促进根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAPs)分化并使SCAPs中的DSPP表达水平上调。在根部牙本质发育过程中，荧光素酶分析发现miR-34a可以直接与NOTCH2和HES1的3′ UTR结合，从而抑制Notch信号通路。研究者[23]采用Notch信号通路的配体JAG1处理SCAPs后，miR-34a表达上调，采用Notch信号通路的抑制剂DAPT处理SCAPs后miR-34a表达下调。因此，miR-34a与Notch信号通路间存在微调控环路。人牙乳头细胞转染miR-34a mimic后，BMP7的表达水平降低，而当转染miR-34a抑制剂后，BMP7表达水平升高[24]。因此，miR-34a可通过靶向BMP7促进人牙乳头细胞向成牙本质细胞方向分化。

小鼠牙乳头细胞转染miR-27 mimic和miR-663 mimic后，以结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白水平降低、β-catenin转移进细胞核为先导的矿化进程加快[25]，miR-27和miR-663均可与APC蛋白的3′ UTR相结合[26]。这一发现也与Wnt信号通路被激活后其在成牙本质细胞分化中的重要作用一致，上述研究结果说明miR-27和miR-663可通过抑制APC蛋白的表达激活Wnt信号通路，从而促进牙本质的发育。

体外研究[27]显示：过表达miR-135b可抑制人牙髓细胞向成牙本质样细胞分化，并抑制SMAD5和SMAD4的表达。荧光素酶分析结果表明：miR-135b通过与SMAD5和SMAD4的3′ UTR相结合并抑制这2种基因的表达。

miR-338-3p通过抑制Runx2促进成牙本质细胞的分化。Runx2是成牙本质细胞分化过程中一种重要的转录因子，miR-338-3p可以下调Runx2的表达。研究[28]显示：抑制miR-338-3p表达可使小鼠牙乳头细胞分化停止，增强miR-338-3p表达可以促进小鼠牙乳头细胞的分化，表明miR-338-3p在间充质干细胞分化为成牙本质细胞中起十分重要的作用。

miR-143和miR-145表达下调在成牙本质细胞分化中也是必要的[29]，过表达miR-143和miR-145会延迟成牙本质细胞的分化和牙本质形成。Kruppel-like factor 4(Klf4)和Osx在成牙本质细胞分化过程中发挥重要作用，miR-145直接与Klf4和Osx基因的3′ UTR区结合，从而在转录后水平抑制其表达。miR-143通过miR-145间接调节Osx的表达，同时Klf4直接抑制miR-143的表达[30]，表明miR-143和miR-145通过1个调控环路参与成牙本质细胞的分化。

2.3 miRNA参与调控釉质发育 釉质是钟状期晚期由成釉细胞分泌的基质矿化后形成的。成釉细胞的发育一般分为分泌前期、分泌期、转化期、成熟期和成熟后期5个时期。分泌前期的细胞为前成釉细胞，分泌前期的结束意味着细胞分化的完成，即成釉细胞的形成。miRNA通过影响成釉细胞分化过程、釉质基质分泌过程和釉质矿化过程影响釉质的形态。见表2。

表2 釉质发育过程中相关miRNAs及其靶基因

啮齿动物的切牙颈环处存在可持续分化的祖细胞，因此其切牙可以持续伸长。miRNA在位于唇侧颈环处的上皮祖细胞向成釉细胞分化过程中发挥重要作用。从祖细胞到前成釉细胞这一转变过程是由祖细胞表达的PITX2启动，而前成釉细胞不表达PITX2。PITX2通过在祖细胞中促进miR-200c/141表达来启动这一转变过程。体内研究[31]显示：miR-200c/141敲除的小鼠表现为下颌切牙釉质矿化缺陷和第三磨牙萌出异常。体外研究[31]显示：miR-200c抑制Noggin表达，促使BMP信号表达上调，进而保持前成釉细胞中miR-200c/141的表达，构成了一个正反馈通路。

此外，miR-96-5p和miR-exon4也参与调控成釉细胞的分化。TBX1、PITX2、miR-96-5p和miR-200c间存在1个调控通路，TBX1可与PITX2相互作用并可抑制miR-96-5p表达[32]。当祖细胞开始分化时，miR-96-5p表达增加，反之抑制Tbx1表达，随后引起Amelx表达上调，从而使细胞增殖率降低。miR-exon4通过调节Runx2的表达参与成釉细胞的分化。体内研究[33]显示：釉原蛋白基因敲除小鼠的miR-exon4表达量减少，Runx2及其下游基因的表达水平均下调。体外向成釉细胞样细胞(LS-8)转染miR-exon4 mimic后，Runx2的表达水平明显上调[33]。

研究[34]显示：miR-26b过表达小鼠表现为切牙和磨牙缺失等发育异常。miR-26b的表达水平与Lef-1的表达呈负相关关系，miR-26b靶向抑制Lef-1的转录活性，使得细胞周期蛋白D1(cyclinD1)等增殖相关蛋白表达减少，从而抑制上皮祖细胞的增殖，引起牙发育异常。

miRNA通过影响TGF-β/BMP信号通路调节釉质发育。体内研究[35]显示miR-214通过影响TGF-β信号通路间接影响釉质的发育。在小鼠磨牙牙胚中转染anti-miR-214引起部分釉质生物合成所必需的蛋白水平下降，导致釉质矿化不全和酸蚀后表面粗糙度降低。基因芯片技术分析结果显示：转染anti-miR-214后，导致其可能的靶基因凝集素(clusterin, CLU)和TGF-β1的表达下调，这2种蛋白质在釉质发育过程中起重要作用[36]。在小鼠肾囊下移植转染miR-135a的磨牙牙胚发现：miR-135a过表达可引起BMPR-ⅠA和BMPR-ⅠB蛋白水平降低，pSMAD-1/5/8水平降低和BMP信号通路表达水平降低[37]。另一方面，肾囊下培养时加入外源性BMP-2可以抑制miR-135a的表达。此外，体外研究[31]显示：miR-203可靶向结合Bmper的3′ UTR的保守序列，其与miR-200c的作用类似，可调节LS-8细胞的分化。

荧光素酶检测结果显示：miR-720与Fgf8 mRNA的3′ UTR结合，参与微调控牙上皮干细胞中Sox2表达[38]。Sox2是牙上皮细胞的特异性标志物，受牙发育起始标志物FGF8的调控。此外，miR-200b在转录后水平参与牙上皮干细胞中Sox2的表达。

此外，miR-224通过与Slc4a4和CFTR mRNA的3′ UTR相结合，调控成釉细胞分化过程中的离子转运，维持pH稳态，参与釉质的矿化[39]。miR-153参与调节釉质发育成熟的过程。与分泌期成釉细胞比较，成熟期成釉细胞中miR-153的表达水平明显下调。在成釉细胞样细胞中miR-153表达水平上调，可抑制其靶基因如Cltc、Lamp1、Clcn4和Slc4a4的表达[40]。miR-182 和miR-141通过调节昼夜节律相关因子Clock和Bmal1表达，参与调节牙发育过程中的昼夜节律。昼夜节律对釉质的发育十分重要，可能影响釉质的形态[41]。

3 miRNA在牙萌出中的作用

牙萌出需要通过牙槽骨的改建来实现。牙萌出分为2种类型，一种是限制性萌出，如人牙和小鼠磨牙的萌出过程；另一种是持续性萌出，如小鼠切牙。牙萌出分别受不同的分子和机制所调节，其中持续性萌出的动力主要来自于切牙颈环，颈环处干细胞不断增殖分化，不断形成釉质和牙本质，促使牙齿的不断伸长。限制性萌出过程与牙槽骨的改建关系更为紧密，因此以下简要介绍限制性萌出。

牙槽骨由牙囊发育而来，牙囊来源于具有多向分化潜能的颅神经嵴间充质。颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia, CCD)是一种常染色体显性遗传病，Runx2基因突变是主要病因，表现为先天性骨骼系统的发育畸形，其中典型口腔异常症状包括乳牙滞留、恒牙迟萌和多生埋伏牙。Runx2既可以调节成骨细胞分化，又可以通过直接或间接作用于OPG/RANK/RANKL轴影响破骨作用。CCD患者的Runx2基因突变不仅影响牙囊细胞的增殖分化，而且抑制牙胚底部的骨形成及牙胚顶部的骨吸收过程，从而阻碍牙萌出。筛选Runx2突变牙囊细胞和正常人牙囊细胞差异表达miRNA的研究[42]显示：Runx2突变牙囊细胞较正常对照牙囊细胞miR-146a和miR-335表达均下调10倍以上，而miR-146a过表达后，Runx2、CSF-1和OPG等基因表达下调，尽管该研究尚未验证牙萌出是否异常，但Runx2基因突变后牙囊细胞中miRNA表达的改变为研究牙萌出提供了新思路。

4 展 望

牙发育是上皮和间充质相互作用和相互诱导的结果，这一过程受到多种信号分子和转录因子的共同调节。miRNA在牙发育过程中的表达具有时间和空间特异性。明确miRNA在牙发育过程中对相关信号分子和转录因子的作用，有助于进一步了解和完善牙发育中上皮和间充质的信号传递。此外，miRNA对靶基因的调控并不是单向的，而是存在反馈通路。需要注意的是，多种miRNA之间存在协同或拮抗作用，一种miRNA可作用于多个靶基因，多种miRNA也可作用于同一个靶基因。简单调控一种miRNA很难达到调控某一种基因表达的目标。据估计，miRNA参与调控人类基因组中60%的基因，目前只有一小部分miRNA已经确定参与了牙发育过程中牙本质、釉质的形成和牙萌出，miRNA对牙根发育的调控作用尚未见报道。此外，miRNA对牙发育的研究绝大多数仍停留在作用机制方面，距离其临床应用仍有较大空间，如牙再生等。因此，miRNA在牙根发育中的作用以及从miRNA的机制研究转化为临床应用是未来的发展趋势和研究方向。