白花丹素对肝癌索拉菲尼耐药细胞HepG2R增殖和凋亡的影响及其机制

朱德强，陈学军

(锦州医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室, 辽宁 锦州121000)

索拉菲尼作为肝癌临床一线药物，能够抑制酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸等多种激酶[1]，有效抑制细胞的增殖。但随着药物的长期使用，临床已经出现严重的耐药现象[2]，降低了索拉菲尼的治疗效果，急需寻找一种药物联合使用以增强其疗效。白花丹素(plumbagin,PLB)作为一种中药单体，研究[3-5]已证实PLB能够明显抑制食管癌、鼻咽癌、肺癌和前列腺癌等细胞的增殖。Pan等[6]研究显示PLB可诱导前列腺癌细胞发生 G/M 期阻滞，引起其生长受限。Checker等[7]发现:PLB能够上调淋巴瘤细胞中caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和磷酸化组蛋白的表达水平，破坏 DNA 双链结构，提高细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，使得肿瘤细胞增殖受抑。研究[8]证明：PLB能升高癌症细胞中ROS水平，但PLB在肝癌索拉菲尼耐药细胞中的作用及机制尚未可知。本研究建立肝癌耐药细胞株HepG2R，观察PLB对耐药细胞增殖和凋亡的影响，探讨其对耐药细胞的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器 人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院细胞库。索拉菲尼(Sorafenib)和PLB购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，MTT 购自美国Promega 公司，结晶紫染色液、Hoechst33342染色、细胞凋亡检测试剂盒和ROS检测试剂盒购自上海碧云天公司，cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体和兔抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司。CO2孵育箱购自美国Thermo公司，细胞流式细胞仪购自美国BD公司，激光共聚焦显微镜购自德国LEICA公司。

1.2 细胞培养和分组 人肝癌HepG2细胞培养在 DMEM 培养基中(含10%FBS、100 IU·mL-1青霉素和 100 mg·L-1链霉素、pH 7.2～7.4)，置于 37℃、5%CO2孵箱中培养，胰蛋白酶消化，每隔2 d以 1∶3 比例传代，调整细胞状态，待细胞处于对数生长期时进行实验。索拉菲尼和PLB分别溶于二甲基亚砜( DMSO)中，存储浓度为10 mmol·L-1，-20℃保存，实验时现配现用，无血清培养基稀释使用。采用逐步提高索拉菲尼浓度持续诱导HepG2细胞建立耐药细胞株HepG2R,药物浓度依次为2、5、8、11、14、17和19 μmol·L-1，反复诱导12周，细胞最终在19 μmol·L-1药物浓度的培养基中稳定生长。将HepG2R细胞随机分为对照组、索拉菲尼(5 μmol·L-1)组、PLB(2 μmol·L-1)组、索拉菲尼(5 μmol·L-1)联合PLB(2 μmol·L-1)组(联合组)。

1.3 MTT法检测各组细胞活力 检测各组药物对细胞增殖的抑制作用。将处于对数增殖期的HepG2和HepG2R细胞铺至96孔培养板，每孔约6 000个细胞，每孔加入100 μL完全培养基，每组设立5个复孔，以不含药物处理的细胞作为阴性对照组。细胞培养48 h后，加入MTT( 5 g·L-1) 溶液，每孔20 μL MTT和80 μL无血清培养基，37℃、5%CO2环境中培养 4 h，轻轻抽掉培养液，每孔加入150 μL DMSO，室温震荡10 min，促使细胞中甲瓒充分溶解，采用酶标仪于波长490 nm处测定各孔内吸光度(A) 值，计算各组细胞活力。细胞活力=给药组A值/空白组A值×100%；绘制细胞活力图，计算HepG2和HepG2R细胞对索拉菲尼的半数抑制浓度(IC50)值；采用同样操作，检测不同浓度PLB作用48 h时和2 μmol·L-1PLB处理不同时间时各组细胞活力，绘制细胞活力直条图。实验均重复5次。

1.4 克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成率 取对数生长期HepG2R细胞，铺6孔板，每孔细胞约5×105个，根据分组情况进行药物处理,药物作用时间约为2周。待阴性对照组细胞长满，取出细胞，PBS 轻轻漂洗2次；以5%甲醛固定30 min，PBS 轻轻漂洗3次；结晶紫染色 30 min，PBS漂洗3次；晾干照相；计算克隆形成率。克隆形成率=给药组细胞数/对照组细胞数×100%。

1.5 Hoechst33342实验检测各组细胞凋亡形态表现 取对数生长HepG2R细胞，以胰蛋白酶消化，均匀铺在12 孔培养板中，待细胞贴壁后，各组分别加入相应药物作用48 h，弃去培养液，以PBS 漂洗3次，加入 Hoechst33342染色液(1 mg·L-1)，避光 37℃孵育20 min，以PBS 漂洗，荧光显微镜随机选取多个视野进行观察并照相。

1.6 流式细胞术(flow cytometry,FCM )检测各组细胞凋亡率 取对数生长期HepG2R细胞，均匀铺在6孔板中培养。按各药物分组，药物处理48 h后消化、离心，预冷PBS重悬，将细胞密度调至细胞 1×105mL-1，按 Annexin Ⅴ-FETC/PI 试剂盒说明书染色，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

1.7 Western blotting法检测各组细胞中cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2相对表达水平 各组细胞经药物作用 48 h后，PBS漂洗2次，消化、离心；采用 RIPA 缓冲液(含1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1% SDS、0.1%PMSF)裂解；按照 BCA 定量说明书定量；SDS-PAGE 电泳；PVDF 膜转膜，1% BSA封闭 1 h；一抗(1∶1 000 稀释)4℃孵育过夜，TBST 漂洗3次，每次10 min；洗膜，二抗(1∶1 000)室温孵育 1 h，TBST 洗涤3次；ECL 显影，计算蛋白相对表达水平。各蛋白相对表达水平=给药组灰度值/对照组灰度值，Bax/Bcl-2比值=给药组Bax灰度值/给药组Bcl-2灰度值。

1.8 各组细胞中ROS水平检测 取对数生长期HepG2R细胞，胰蛋白酶消化，均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁后，各组分别加入相应药物作用48 h，按照ROS检测试剂盒操作并照相，计算ROS水平。ROS水平=实验组绿色荧光细胞数/对照组绿色荧光细胞数×100%。

2 结 果

2.1 肝癌索拉菲尼耐药细胞的建立和鉴定 小剂量持续给药建立肝癌耐药细胞株HepG2R，MTT法检测索拉菲尼对正常肝癌细胞株HepG2和耐药细胞株HepG2R增殖的抑制作用，以细胞活力为纵轴、以药物梯度为横轴绘制药效曲线，见图1。耐药细胞株HepG2R对索拉菲尼的IC50值是HepG2的4.5倍(P=0.025)，耐药细胞株建立成功，见图2。

2.2 不同条件下各组细胞活力 PLB(0 μmol·L-1)处理细胞时，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)处理细胞对HepG2R细胞活力无影响(P=3.579)；PLB(1 μmol·L-1)处理细胞时，与未加索拉菲尼组比较，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后细胞活力降低(P=0.032)；PLB (2 μmol·L-1)处理细胞时，与未加索拉菲尼组比较，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后细胞活力降低(P=0.006)；随着PLB浓度升高，HepG2R细胞对索拉菲尼敏感性升高，见图3A。药物作用24 h,与索拉菲尼组比较,联合组细胞活力降低(P=0.029)；药物作用48 h后，与索拉菲尼组比较,联合组细胞活力明显降低(P=0.000)；药物作用48 h，与PLB组比较，联合组细胞活力降低(P=0.012)，见图3B。

图1 HepG2和HepG2R细胞对索拉菲尼的药效曲线

Fig.1 Pharmacodynamic curves of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

*P<0.05 compared with HepG2 cells.

Fig.2 IC50values of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

2.3 各组细胞克隆形成率 作用2周后，联合组细胞克隆形成率(58.29%±1.16%)明显低于索拉菲尼组(88.32%±2.06%)和PLB组(81.65%±1.32%)，差异有统计学意义(P=0.000，P=0.021)。见图4和5。

*P<0.05 compared with PLB (without sorafenib) group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with sorafenib group；#P<0.05 compared with PLB group.

图3 不同浓度PLB作用48 h时(A)和2 μmol·L-1PLB作用不同时间时(B)各组细胞活力

Fig.3 Cell vitalities in various groups after treated with different concentrations of PLB at 48 h after treatment (A) and treated with 2 μmol·L-1PLB for different treatment time

2.4 各组细胞细胞核凋亡形态表现 Hoechst 33342染色结果显示：各组药物作用48 h后，对照组细胞核淡染，索拉菲尼组和PLB组细胞核少部分浓染、明亮，联合组细胞核大部分浓染，细胞核染色质固缩、明亮。见图6(插页五)。

2.5 各组细胞凋亡率 联合组细胞凋亡率(35.92%±1.02%)明显高于索拉菲尼组(7.16%±0.83%)和PLB组(9.27%±0.97%)(P=0.003，P=0.001)。见图 7。

2.6 各组细胞中凋亡相关蛋白相对表达水平和Bax/Bcl-2比值 各组药物作用48 h后，Western blottiing法检测各组细胞中凋亡相关蛋白相对表达水平。与索拉菲尔组比较，联合组细胞中cleaved Caspase-3相对表达水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.000，P=0.001)；与PLB组比较，联合组细胞中cleaved Caspase-3相对表达水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.001，P=0.002)。见图8和9。

2.7 各组细胞中ROS水平 对照组、PLB组和索拉菲尼组细胞中ROS水平较低，联合组细胞中ROS水平明显高于索拉菲尼组(P=0.002)和PLB组(P=0.005)。见图10(插页五)和图11。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

图4 各组细胞克隆形成情况

Fig.4 Clone formation of cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.05 compared with PLB group.

图5 各组细胞克隆形成率

Fig.5 Clone formation rates of cells in various groups

3 讨 论

肝细胞癌作为我国最常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率居高不下，临床多以手术治疗为主，但术后极易复发[2, 9]，一些化疗药物的出现延缓了肝癌的进展，缓解了病情。索拉菲尼作为肝癌临床治疗的一线化疗药物，能有效地抑制丝氨酸/苏氨酸激酶和血小板衍生生长因子受体，还能抑制受体酪氨酸激酶血管表皮生长因子受体 2、网织红细胞以及酪氨酸激酶受体等，从而阻止肿瘤细胞增殖和血管生成,但是肝癌索拉菲尼耐药现象的出现严重限制其治疗效果和应用。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

肝癌对索拉菲尼耐药的机制十分复杂，随着耐药现象的出现，药物疗效的不断下降，急需寻找一种化疗增敏剂来抵抗药物耐受。研究[10-12]显示：天然药物PLB具有良好的抗肿瘤作用，PLB来源于白花丹的根部提取物，对前列腺癌、乳腺癌和肺癌等具有良好的治疗效果。研究[13]显示：PLB能提高肿瘤细胞ROS水平，使肿瘤细胞增殖受到抑制。PLB还可降低急性髓性白血病HL-60细胞中Bcl-2表达水平，增加 Bax 表达水平，明显升高caspase-3表达水平，促进细胞凋亡。

Lane 1:Control group; Lane 2:Sorafenib group; Lane 3:PLB group; Lane 4:Combination group.

图8 各组细胞中凋亡相关蛋白表达电泳图

Fig.8 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.01 compared with PLB group.

图9 各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平

Fig.9 Expression levels of apoptosis-related proteins in cells in various groups

图11 各组细胞中ROS水平

氧化应激是体内微环境改变导致的一种氧化反应，引起大量氧化中间产物的形成，其中ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等，体内多种疾病的发生均与之有关[14-17]。文献[18-19]报道：ROS水平升高能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，与降低细胞线粒体膜电位有关，细胞因缺少ATP会引起自噬。自噬作为细胞的一种应激反应[20- 23]，细胞本身吞噬自身细胞质蛋白或细胞器使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，藉此实现本身的代谢需要和某些细胞器的更新。本实验通过索拉菲尼小剂量持续给药培养肝癌HepG2细胞，制备耐药细胞模型HepG2R，采用MTT实验确定药物作用浓度和时间，根据筛选的药物浓度和时间进行分组，比较各组细胞增殖和凋亡情况，发现PLB能明显增强耐药细胞对索拉菲尼的敏感性，并且提高耐药细胞中ROS水平，与既往研究结论相符。

本研究为临床肝癌索拉菲尼耐药的治疗提供了理论和实验依据，但仍存在诸多不足，未来应该进行更多动物实验和临床研究探讨耐药细胞增敏的具体机制，为临床治疗肝癌耐药提供一个新方案。