壳聚糖对冷藏鲤鱼片品质变化的影响

孙小惠，薛 衡，洪 惠，李 燕，罗永康*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

鲤鱼（Cyprinus carpio）原产亚洲，是淡水鱼类中分布最广、养殖历史最悠久的温带淡水经济鱼类[1]。鲤鱼肉质细嫩、营养丰富、蛋白质含量高，脂肪多以不饱和脂肪酸为主，易被人体消化吸收[2]，并且能给人体提供必需的氨基酸、维生素等营养成分[3]。但鱼肉由于水分含量高、组织细嫩、蛋白水解酶活性较强，易发生腐败变质[4]。因此，探究水产品有效的贮藏保鲜方法对降低损失、提高经济效益、促进水产品行业的生产发展至关重要[5]。

目前，水产品的贮藏保鲜方法主要有气调保鲜、低温保鲜及化学保鲜等[6]。近年来，各类天然保鲜剂逐渐成为水产保鲜行业的研究热点。壳聚糖是α-氨基-D-葡胺糖通过β-1,4-糖苷键连接形成的直链状多糖，可以通过甲壳素脱乙酰制得[7]，具有抗菌性、成膜性及无毒无害等多种优良特性[8]。壳聚糖容易在物体表面形成对O2、CO2、C2H4具有一定选择渗透作用的半透膜，可以有效减少微生物的污染[9]。由于壳聚糖具有多种优点，已经逐渐成为天然食品添加剂领域研究的热点材料[10]。

Hassanzadeh等[11]研究含葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）的壳聚糖食用涂料对冷藏虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）片货架期的影响，指出经2%壳聚糖涂膜的虹鳟鱼块的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、过氧化值（peroxide value，POV）和pH值均低于对照组鱼片，并且加入0.1% GSE的壳聚糖涂膜具有更好的效果，在抑制需氧嗜温和嗜冷细菌方面效果显著，可以帮助维持感官质量并延长虹鳟鱼片在冷藏条件下的货架期。Gómez-Estaca等[12]研究壳聚糖与丁香精油结合对鳕鱼（Pollachius pollachius）的保鲜效果，结果表明，壳聚糖与丁香精油结合处理能够显著抑制革兰氏阴性杆菌的生长，特别是有效抑制肠杆菌的增长。Li Tingting等[13]研究茶多酚、迷迭香提取物与壳聚糖相结合对4 ℃冷藏大黄鱼（Pseudosciaena crocea）的保鲜效果，结果表明，0.2%茶多酚和0.2%迷迭香浸渍处理后与壳聚糖包衣相结合可以有效保持鱼片的品质，并且与对照组相比，保质期延长8～10 d。Mohan等[14]研究食用壳聚糖涂层（1%和2%）对冰冻印度油沙丁鱼（Sardinella longiceps）品质的影响，结果表明，壳聚糖食用涂层可以有效抑制细菌生长，显著减少挥发性碱和氧化产物的形成，并且提高鱼肉的持水能力。

目前，壳聚糖对冷藏鲤鱼片品质影响方面的研究较少，且壳聚糖不溶于水，能溶于稀酸，大多数研究均采用醋酸溶解壳聚糖形成的溶液来处理鱼片。醋酸本身具有一定的防腐和抑菌效果，因此无法判断在此过程中壳聚糖自身所发挥的效应。因此本研究以鲤鱼为研究对象，通过测定4 ℃冷藏条件下对照组、20 g/L壳聚糖+0.5%醋酸组以及0.5%醋酸组鲤鱼片的感官分值、菌落总数（total aerobic counts，TAC）、生物胺含量、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量及pH值等指标，探讨壳聚糖对鲤鱼片品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

25 条鲤鱼购于北京北医三院农贸市场，平均体质量（0.98±0.03） kg，平均体长（37.00±1.00） cm；壳聚糖购于国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KDY-9820半自动凯式定氮仪 北京通润源机电仪器设备公司；DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；BCD-251WBCY冰箱 青岛海尔股份有限公司；YT-C1-1ND超净工作台 北京亚泰科隆实验科技开发中心；FW2000高剪切分散乳化机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；LC-10AT series高效液相色谱仪 日本岛津公司；FE20 pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲤鱼预处理

鲜活鲤鱼运到实验室后，立即宰杀、去鳞、去头、去内脏，清洗内部及体表，每条鱼取两侧鱼片，单条鲤鱼耗时约5 min。使用自来水将鱼片表面清洗干净并沥干，将鱼片分为3 组。对照组置于聚乙烯保鲜袋中，于4 ℃冰箱中贮藏；T1组用20 g/L壳聚糖+体积分数0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鲜袋中，于4 ℃冰箱中贮藏；T2组用体积分数0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鲜袋中，于4 ℃冰箱中贮藏。每隔2 d每组随机取3 块鱼片进行TAC、TVB-N含量、生物胺含量、感官分值和pH值的测定。

实验前对不同体积分数醋酸溶解的壳聚糖溶液进行可接受性测试，最终选择0.5%作为醋酸的最终体积分数。

1.3.2 感官分值测定

参照周忠云等[15]的方法。由经过培训的8 名实验室成员组成感官评价小组，根据表1所示的鲤鱼感官评分标准进行打分。各项目指标分5 级，最高分为5 分，最低分为1 分，总分为20 分。将4 个项目的总分计为该鱼块的综合得分，感官分值低于12 分认为无法食用。

1.3.3 TVB-N含量测定

参照Hong Hui等[16]的方法，并稍作修改。取5.00 g绞碎的鱼肉，加入50 mL蒸馏水，均质25 s后置于摇床上振摇30 min，离心3 min（3 600 r/min）；取5 mL离心管中的上清液和5 mL氧化镁悬浊液（10 g/L）于消化管中混合后进行蒸馏，向10 mL硼酸溶液（20 g/L）中加入50 µL甲基红-次甲基蓝指示剂（2 g/L）作为吸收液，蒸馏5 min；用盐酸标准溶液（0.01 mol/L）进行滴定，根据消耗的盐酸标准溶液体积计算TVB-N含量，滴定终点为蓝紫色。

1.3.4 pH值测定

参照汪之颖等[17]的方法，使用pH计进行测定。

1.3.5 TAC测定

参照胡素梅等[18]的方法，并稍作修改。在超净工作台中称取5.00 g鱼肉，放入拍打袋内，向其中加入45 mL无菌生理盐水，放入拍打式均质机拍打15 s，制成质量浓度为10 g/mL的样品稀释液；用4.5 mL的无菌生理盐水进行梯度稀释。选择2～3 个合适的稀释度，用平板涂布法进行测定。培养条件：（30±1） ℃，72 h。

1.3.6 生物胺含量测定

参照Shi Ce等[19]的方法，并稍作修改。取5.00 g绞碎的鱼肉，加入10 mL 0.6 mol/L、4 ℃的高氯酸溶液，匀浆20 s，4 ℃条件下离心（10 000×g，5 min）后，取上清液，所得沉淀重复上述步骤，合并2 次离心所得上清液，用0.6 mol/L高氯酸溶液将其定容至25 mL。提取液保存在-20 ℃条件下待测。

生物胺的衍生：取0.2 mL生物胺提取液，依次加入40 μL 2 mol/L氢氧化钠溶液、60 μL饱和碳酸氢钠溶液和0.4 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，丙酮溶解），混合均匀后于40 ℃条件下避光反应45 min，残余的丹磺酰氯用20 μL的浓氨水去除；室温静置30 min后，用乙腈调整体积至1 mL，最后用0.22 μm的有机相滤膜过滤。

液相色谱检测条件：色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；进样量50 μL；流动相A为0.1 mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；采用梯度洗脱方式，洗脱程序为：0 min，50%流动相B；25 min，90%流动相B；35 min，90%流动相B；45 min，50%流动相B；流动相流速0.8 mL/min；检测波长254 nm。通过比较样品和生物胺标品的保留时间和峰面积进行定性及定量分析。

1.4 数据处理

实验数据均为3 个平行，采用Excel 2013进行数据处理，SPSS软件进行单因素方差分析，各组数据之间的差异性用最小显著性差异法在0.05的置信区间（P＜0.05）进行分析，实验结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对冷藏鲤鱼片感官品质的影响

图1 鲤鱼片贮藏期间的感官分值变化Fig.1 Changes in sensory scores of carp fillets during storage

由图1可知，3 组鲤鱼片的感官分值均随着贮藏时间的延长而下降。贮藏前4 d，3 组鲤鱼片的感官分值均缓慢下降，且无显著性差异（P＞0.05）；贮藏4 d后，随着贮藏时间的延长，对照组鲤鱼片的感官分值下降最快，在贮藏第6、8、10天时的感官分值分别下降至13.32、11.33、7.24 分，贮藏8 d时已经伴随明显的腐败臭味，这与吕健等[20]对冷藏鳙鱼片的研究结果相似。T1、T2组鲤鱼片的感官分值变化趋势较为相似，但T2组鲤鱼片的感官分值在贮藏期间低于T1组，这主要是由于T2组鲤鱼片有轻微的酸味，鱼肉体表泛白且弹性较差。贮藏8 d时T1、T2组鲤鱼片的感官分值分别降至15.10和14.36，并在10 d后不可接受。与对照组相比，T1组鲤鱼片的感官可接受时间延长了约2 d，这可能是由于壳聚糖和醋酸抑制了微生物的繁殖，从而延缓了鲤鱼片感官品质的劣变。

2.2 壳聚糖对冷藏鲤鱼片TVB-N含量的影响

图2 鲤鱼片贮藏期间的TVB-N含量变化Fig.2 Changes in TVB-N content of carp fillets during storage

TVB-N是评价鱼肉腐败变质的常用指标，TVB-N含量越大说明肉类的腐败程度越高[21]。由图2可知，鲤鱼片的初始TVB-N含量为5.32 mg/100 g。贮藏前6 d，各组鲤鱼片的TVB-N含量平稳上升，无显著差异（P＞0.05），这是由于贮藏初期的TVB-N主要来源于腺嘌呤核苷酸在内源酶作用下发生的脱氨反应，此时鱼肉中的微生物正处于被抑制生长的状态，直至后期微生物进入对数生长期，代谢作用旺盛，才使TVB-N含量快速增加[22]。随着贮藏时间的延长，对照组鲤鱼片第8天时的TVB-N含量显著升高（P＜0.05），在贮藏10 d时达到最大值31.37 mg/100 g，超过淡水鱼TVB-N含量的二级鲜度标准（20 mg/100 g），与T1、T2组差异显著（P＜0.05），这与Zhang Yuemei等[23]对鲤鱼片的研究结果相类似。T1组鲤鱼片的TVB-N含量在贮藏10 d时出现较为明显的上升，达13.07 mg/100 g（＜20 mg/100 g）。T2组鲤鱼片的TVB-N含量变化趋势与T1组类似，在贮藏10 d时达15.96 mg/100 g。整个贮藏过程中，T1、T2组鲤鱼片的TVB-N含量均未超过二级鲜度标准，并且T1组低于T2组。壳聚糖作为一种抗菌剂，能够抑制部分微生物的生长繁殖，对微生物分解鱼肉蛋白质具有一定的抑制作用，同时可以抑制酶的活性，由此可以看出壳聚糖具有延缓腐败的作用。

2.3 壳聚糖对冷藏鲤鱼片pH值的影响

图3 鲤鱼片贮藏期间的pH值变化Fig.3 Changes in pH value of carp fillets during storage

由图3可知，随着贮藏时间的延长，3 组鲤鱼片的pH值均先下降后上升。生鲜鲤鱼片的pH值为6.84，对照组鲤鱼片在贮藏第2天下降到最低值（6.47），T1、T2组在第4天下降至最低值，分别为6.48和6.59。贮藏初期，糖原酵解产生乳酸，ATP、磷酸肌酸等物质分解产生磷酸等酸性化合物，使得鱼肉的pH值逐渐降低，但随着贮藏时间的延长，鱼肉进入自溶腐败阶段，其中的蛋白质在微生物的作用下发生分解，产生碱性物质，使鱼肉的pH值逐渐升高[24]。贮藏第10天，对照组鲤鱼片的pH值升高至7.02，而T1组为6.72，显著低于对照组（P＜0.05），并且低于T2组。醋酸的加入使鱼片的pH值保持在较低的水平，同时，壳聚糖的加入能够抑制鲤鱼片中微生物的生长繁殖，延缓pH值的变化，改善鱼肉品质。

2.4 壳聚糖对冷藏鲤鱼片TAC的影响

鱼肉中的各类微生物是引起鱼肉腐败变质的重要原因[25]。由图4可知，对照组鲤鱼片的初始菌落总数为3.49 （lg（CFU/g）），而T1、T2组鲤鱼片的初始菌落总数分别为2.71、3.10 （lg（CFU/g）），这可能是由于醋酸及壳聚糖处理具有杀灭微生物的作用。3 组鲤鱼片的TAC均随着贮藏时间的延长显著升高（P＜0.05）。贮藏前4 d，对照组鲤鱼片的微生物生长速率显著高于T1、T2组（P＜0.05），并在贮藏6 d时达到7.46 （lg（CFU/g）），超过微生物可接受标准（7.00 （lg（CFU/g）））[26]，这与王航等[27]的研究结果相似。T1组鲤鱼片的TAC显著低于对照组与T2组（P＜0.05），并在贮藏8 d时达到7.31 （lg（CFU/g）），表明壳聚糖具有一定的抑菌作用。T2组鲤鱼片的TAC在贮藏前4 d显著低于对照组（P＜0.05），但在4 d后迅速上升，并在6 d时达到7.41 （lg（CFU/g）），可以看出醋酸本身具有一定的抑菌效果，但壳聚糖结合醋酸的抑菌效果最好。

图4 鲤鱼片贮藏期间的TAC变化Fig.4 Changes in TAC of carp fillets during storage

2.5 壳聚糖对冷藏鲤鱼片生物胺含量的影响

表2 鲤鱼片贮藏期间的生物胺含量变化Table 2 Biogenic amine concentrations in carp fillets during storage mg/kg

由表2可知，所有样品中，精胺是主要生物胺，其在被检测的5 种生物胺（腐胺、尸胺、组胺、亚精胺和精胺）中含量最高，这与张月美等[28]的研究结果相似。腐胺、尸胺和组胺的含量通常用于确定鱼肉的品质和安全性，Marks等[29]的研究也指出，腐胺和尸胺可以更好地反映鱼体的腐败程度。

鲤鱼片中组胺含量为0.46～2.20 mg/kg，远低于规定的组胺最大限量值50 mg/kg[30]。在贮藏过程中，3 组鲤鱼片的组胺含量均呈先升高后降低的趋势，这可能是由于随着腐败程度的增大，微生物的增加利用了部分组胺，3 组样品的组胺含量未见显著差异（P＞0.05）。贮藏初期，3 组鲤鱼片中的腐胺和尸胺含量均较低，但随着贮藏时间的延长，腐胺和尸胺的含量显著上升（P＜0.05）。新鲜鲤鱼片的腐胺含量为0.27 mg/kg，在贮藏8 d后达到1.01 mg/100 g，而T1、T2组分别达0.48、0.65 mg/kg，均显著低于对照组（P＜0.05）。贮藏第10天，对照组鲤鱼片的腐胺含量达5.91 mg/100 g，T2组达1.26 mg/100 g，而T1组仅为0.60 mg/100 g，显著低于对照组和T2组（P＜0.05）。对照组鲤鱼片贮藏10 d时的尸胺含量为0.86 mg/100 g，显著高于T1、T2组（P＜0.05），并且在贮藏末期，T1组鲤鱼片的尸胺含量显著低于T2组（P＜0.05）。腐胺含量在贮藏后期迅速上升，这可能是由于贮藏后期鱼肉中的微生物大量生长繁殖并产生氨基酸脱羧酶，氨基酸脱羧基而形成[31]。T1组鲤鱼片贮藏后期的腐胺、尸胺含量显著低于对照组和T2组，这可能是由于壳聚糖抑制了能够产氨基酸脱羧酶微生物的生长。

3 结 论

在4 ℃冷藏条件下，鲤鱼片的感官分值随着贮藏时间的延长不断下降，TVB-N含量、TAC、腐胺和尸胺的含量呈现明显上升趋势；使用20 g/L壳聚糖+体积分数0.5%醋酸处理鲤鱼片后发现，其能抑制鲤鱼片中微生物的生长，延缓TVB-N、腐胺和尸胺含量的上升以及pH值的变化，降低鱼片的腐败速率，延缓鲤鱼片感官品质的下降。鲤鱼片在4 ℃冷藏条件下的货架期约为8 d，壳聚糖处理可将鲤鱼片的货架期延长2 d。