黑米花青素的醇提工艺优化

,,,, ,

(西南科技大学植物分子遗传育种实验室,四川绵阳 621010)

黑米是稻米中的珍贵品种,不仅含有丰富的蛋白质、人体所必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素C 及钙、铁、锌等矿物营养元素,还含有具药用价值的花青素[1]。花青素属于植物多酚中的类黄酮类物质,是广泛存在于自然界中的一类水溶性天然色素,具有抗氧化性、预防心脑血管疾病与癌症、保护肝脏与视力等功能[2],在食品、医药、化妆品等方面都有重要的应用[3-4]。我国黑米种质资源十分丰富,现收集保存的就有373个[5]。于斌等[6]研究认为黑米花青素可能通过抑制移植瘤内血管生成而抑制肿瘤生长,韩彬等[7]发现黑米花青素能够抑制乳腺癌细胞异种移植瘤向肺转移,该抑制作用可能与黑米花青素抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞凋亡有关,Wen等[8]研究发现,从紫甘薯提取的花青素与现有的食品防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾相比有增强的抗真菌特性,所以深入研究花青素的提取工艺对黑米的开发与深加工具有重要意义。

因为黑米花青素的重要性,其不同介质的提取工艺受到广泛关注;由于乙醇无毒且易去除,因此黑米花青素的乙醇提取工艺成为研究的焦点。侯召华等[9]通过单因素实验和正交试验得出黑米花青素最佳提取条件为提取液乙醇-水-盐酸体积比为50∶50∶0.5，温度50 ℃，固液比为1∶10 (g∶mL)，提取时间为1 h，提取次数为3次;Bae等[10]研究黑米花青素提取的优化工艺后认为,乙醇体积分数50.78%和1 N HCl(0.60 mL)的提取产物中矢车菊-3-葡萄糖苷含量能达到624.27 mg。吴素萍[11]利用单因素实验和正交试验得到最佳提取工艺为乙醇体积分数50%,粉碎度50目,料液比1∶5,浸提时间30 min,浸提温度80 ℃,浸提pH为3;石娟[12]通过单因素和正交试验得到黑米花青素最佳提取条件为:提取时间100 min、提取温度40 ℃、料液比1∶8、pH3.2;吴娟等[13]利用萃取法对黑米花青素提取工艺进行研究,得到最佳条件是以无水乙醇为萃取剂，料液比1∶8，萃取时间60 min，温度80 ℃。严红光等[14]在以兔眼蓝莓果渣为原料、乙醇为提取溶剂提取花青素的研究中发现,乙醇体积分数是影响花青素提取率高低的最主要因素。张莉弘等以蓝莓为原料、乙醇为提取溶剂的花青素提取研究中,显示提取温度是影响花青素得率的最主要因素[15]。从上述结果看,其现有提取工艺条件存在较大差异。

花青素在可见光区域的最大吸收波长在500～550 nm范围内。田喜强等[16]扫描黑米花青素提取液的吸收光谱,发现其最大吸收波长为530 nm。因此,本研究选用530 nm作为最大吸收波长检测在各试验条件下的光密度(optical density,OD)值,在单因素实验和正交试验中暂时以OD值代表花青素含量。目前花青素的提取工艺虽有报道,但对黑米花青素的提取还缺少一套完整的体系,并且黑米花青素的提取率都急需提高。所以本试验采用无水乙醇为提取液提取黑米花青素,通过单因素和正交试验确定最佳溶剂浓度、提取温度、料液比、提取时间及提取液pH以得到优化的提取工艺,为黑米花青素的工业化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

固城黑糯 西南科技大学植物分子遗传育种实验室;无水乙醇 分析纯,成都市科龙化工试剂厂;盐酸 分析纯,成都市欣海兴化工试剂厂;矢车菊-3-葡萄糖苷 上海金穗生物科技有限公司。

TR-200电动砻谷机 日本Kett;Lm3100高速锤式粉碎机 瑞典Perten;T6紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;DHP-9082电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;5415R冷冻离心机 德国Eppendorf;PH2100型pH计 美国EUTECH;电子天平 美国DENVER。

1.2 实验方法

1.2.1 黑米花青素的单因素提取实验 参考石娟[12]及郭梅等[17]方法并进行改进,将固城黑糯稻谷用电动砻谷机脱壳为糙米,再用高速锤式粉碎机磨成过100目筛的黑米粉;取1 g黑米粉放入烧杯中,加入一定体积的乙醇,调节至一定pH,杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,在一定温度下浸提一定时间后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度OD值,提取1次;重复3次。

1.2.1.1 乙醇体积分数对花青素含量的影响 分别取5份1 g黑米粉放入烧杯中,固定料液比(质量体积比)为1∶10 (g∶mL),提取时间为120 min,提取温度为30 ℃,提取液pH为2,分别加入75%、80%、85%、90%、95%的无水乙醇,杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,浸泡后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度,确定最佳乙醇浓度。

1.2.1.2 提取时间对花青素含量的影响 分别取5份1 g黑米粉放入烧杯中,固定提取温度为30 ℃,提取液pH为2,乙醇体积分数为90%,料液比(质量体积比)为1∶10 (g∶mL),杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,分别浸泡60、80、100、120、140 min后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度,确定最佳提取时间。

1.2.1.3 料液比对花青素含量的影响 分别取5份1 g黑米粉放入烧杯中,固定提取时间为120 min,提取温度为30 ℃,提取液pH为2,乙醇体积分数为90%,按料液比1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11分别加入配好的乙醇溶液,杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,浸泡设定时间后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度,确定最佳料液比。

1.2.1.4 提取温度对花青素含量的影响 分别取5份1 g黑米粉放入烧杯中,固定提取液pH为2,乙醇体积分数为90%,料液比(质量体积比)为1∶10 (g∶mL),提取时间为120 min,杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,分别置于30、40、50、60、70 ℃的恒温培养箱中浸泡设定时间后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度,确定最佳提取温度。

1.2.1.5 提取液pH对花青素含量的影响 分别取5份1 g黑米粉放入烧杯中,固定乙醇体积分数为90%,料液比(质量体积比)为1∶10 (g∶mL),提取时间为120 min,提取温度为30 ℃,调节溶液pH以0.5为梯度从1～3,杯口用封口膜扎紧防止水分蒸发,浸泡设定时间后,4000 r/min离心15 min,取上清液稀释定容至100 mL,在530 nm的波长下测定吸光度,确定最佳提取pH。

1.2.2 正交试验 根据单因素实验的结果,选取提取乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度和提取pH五个因素进行5因素4水平的正交设计,确定提取黑米花青素的最优工艺。每个试验号测定OD值时重复3次。具体因素及水平见表1。

表1 黑米花青素提取工艺的正交因素与水平Table 1 Orthogonal test factors and levels of extracting process for black rice anthocyanin

1.2.3 确定最佳提取次数 根据正交试验优化的提取工艺参数,由鲍晓亮[18]、姚钰蓉[19]的方法测定最佳提取次数。

相对提取率:P(%)=(∑An/∑AN)×100

式中，∑An-提取n次花青素吸光度总和；∑AN-提取N次(总次数)花青素吸光度总和。

此相对提取率是指每次提取或者多次提取后在总获得量中其所占比例的高低。

1.2.4 花青素含量和得率的测定 Pedro等[20]和He等[21]研究黑米花青素的提取和稳定性时,发现黑米中的主要花青素类型是矢车菊-3-葡萄糖苷,因此,以矢车菊-3-葡萄糖苷标准品绘制标准曲线。称取10 mg矢车菊-3-葡萄糖苷标准品溶于pH为2的乙醇溶液中,定容至10 mL为母液,再配成浓度分别为 10、20、30、40、50 μg/mL的系列标准液,用分光光度计测定吸光度。以矢车菊-3-葡萄糖苷浓度为横坐标,以其吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得矢车菊-3-葡萄糖苷浓度为自变量、吸光度为因变量的标准曲线方程,根据该方程可计算不同条件下的花青素含量。

提取的花青素总重量(μg)=(提取液体积×首次提取液的花青素含量×花青素相对总提取率)/首次花青素相对提取率

花青素得率(μg/g)=(提取的花青素总重量/样品重量)=(提取液体积×首次提取液的花青素含量×花青素相对总提取率)/(首次花青素相对提取率×样品重量)

1.3 数据分析

本研究中利用R软件(v3.4.1)的lm()函数进行模型拟合,anova()函数进行方差分析;其它数据的分析和处理用Excel 2010进行。

2 结果与分析

2.1 花青素单因素提取实验

2.1.1 乙醇体积分数对花青素含量的影响 由图1可以看出随着乙醇浓度的升高,黑米提取液中的花青素含量在不断增加;当乙醇浓度为90%时,其花青素含量最高,当乙醇浓度大于90%后提取液中的花青素含量开始降低,其原因可能在于一些醇溶性杂质以及亲脂性强的成分溶出量增加,这些成分与花青素一起竞争同乙醇-水分子结合的机会,从而导致花青素含量下降[22]。

图1 乙醇体积分数对花青素提取的影响Fig.1 Influence of ethanol volume fraction on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.2 提取时间对花青素含量的影响 由图2可知随着提取时间的增加提取液中的花青素含量增加;当提取时间为80 min时提取液中花青素的含量最多;之后随着时间的继续增加,提取液中花青素的含量却缓慢下降,这可能是因为达到一定的时间后,提取出来的花青素慢慢的氧化了,同时随着黑米中多糖及蛋白质等大分子溶出增加,与花青素形成分子复合物增多,导致测量提取液中花青素含量时数值降低[23]。

图2 提取时间对花青素提取的影响Fig.2 Influence of extracting time on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.3 料液比对花青素含量的影响 由图3可知从黑米中提取的花青素含量随着液料比的增加而增加;当液料比为1∶9时,提取的花青素的含量达到最大;随着料液比的继续增加,提取液中的黑米花青素含量明显下降,这可能是因为随着液料比的增大,其中水体积增加,使水中吸附更多的氧,使更多的黑米花青素氧化,造成提取液中的花青素含量降低[24]。

图3 料液比对花青素提取的影响Fig.3 Influence of ratio of solid-liquid on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.4 提取温度对花青素含量的影响 由图4可知,随着温度的升高,黑米花青素的提取效果越来越好,这可能是因为在相对较低的温度下花青素与蛋白质等结合物分离缓慢,使花青素的提取效果不理想;当温度升至50 ℃时提取效果最好;温度大于50 ℃后,黑米花青素的提取效果缓慢下降。根据吕丽爽[22]分析,由于花青素蓝色的醌式碱与红色的黄佯盐阳离子可逆,温度过高后反应平衡向查尔酮方向移动,其结果是显色物质含量下降。而且,较高温度下,花青素结构容易被破坏,这就导致提取液中花青素含量降低[25]。

图4 温度对花青素提取的影响Fig.4 Influence of temperature on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.5 提取pH对花青素含量的影响 由图5可知在黑米花青素的提取过程中,pH对提取液中的花青素含量有较大的影响。pH为2时,花青素含量达到最大值;在pH较低时花青素含量也相对较大,这是因为花青素在较低的pH环境中有光和热的稳定性;pH大于2后,随着pH的升高,花青素含量显著下降,说明较大的pH会加速花青素的降解[26]。

图5 pH对花青素提取的影响Fig.5 Influence of pH of extracting solution on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.2 正交试验优化工艺

正交试验首次提取花青素的OD值见表2。根据表2的正交结果及极差分析可知,5个因素中极差值最大的是因素E pH,最小值为因素D提取温度,说明5个因素中pH对花青素提取量影响最大,而提取温度影响最小,5个因素对黑米花青素得率高低的影响顺序为pH>提取时间>液料比>乙醇体积分数>温度。直接分析与计算得到的提取最优水平一致,为A1B1C1D1E1,即乙醇体积分数为80%,提取时间为60 min,提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g∶mL),提取液pH为1。采用该优化工艺后,花青素首次提取液的OD值达到0.637,即试验设计中的第一组提取花青素的效果最好。

表2 黑米花青素提取工艺的正交结果Table 2 Orthogonal test results of anthocyanin extraction technique from black rice

为进一步确认各试验因素的可信度,对黑米花青素提取的正交设计试验结果进行方差分析(见表3),以合并误差进行F测验。由表3可知,5个试验因子对试验结果的影响均达到极显著水平(p<0.01)。

表3 正交试验结果的方差分析表Table 3 Analysis of variance for the result of orthogonal experiment design

2.3 提取次数的确定

在乙醇体积分数为80%,提取时间为60 min,提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g∶mL),提取液pH为1的最优工艺条件下进行黑米花青素的提取。由表4可知,随着提取次数的增加,黑米花青素的相对提取率也逐渐增加,首次提取时,花青素的相对提取率达到80.03%,提取第二次时相对提取率增加较大,第三次的时候增加幅度变小,第四次时影响已经明显减小,所以从省时、省料上考虑最佳提取次数为3次,其花青素的相对总提取率达到99.29%。

表4 提取次数研究结果Table 4 Results of extracting times

2.4 花青素含量和得率

以矢车菊-3-葡萄糖苷为标准品绘制花青素含量测定的标准曲线如图6。其标准曲线方程为y=0.0187x-0.0054,R2=0.9981,式中y为吸光光度值,x为矢车菊-3-葡萄糖苷浓度。将正交设计的16个实验号代入公式计算发现,实验1号的首次提取液花青素含量最高,为34.34 μg/mL,其次为实验15号,为25.46 μg/mL,第三为实验9号,为24.89 μg/mL,而实验14号的花青素含量最低,仅为3.19 μg/mL。

图6 花青素标准曲线Fig.6 Standard curve of Anthocyanin

因此,根据1.2.4花青素得率的计算公式,采用实验1号的最佳提取工艺,1 g黑米粉经3次提取后,花青素的得率为298.23 μg/g。如果分别采用实验15、9和14号工艺,1 g黑米粉经3次提取后,其花青素得率则分别仅为221.11,216.16和27.70 μg/g,与实验1号工艺相比,花青素得率大幅下降。

3 讨论

黑米花青素是自然界天然花青素的主要来源之一,黑米花青素提取涉及到较多的工艺参数。Abdel-Aal等[27]证明在其研究的所有有色籽粒中,黑米有最高的花青素含量(3.28 mg/g)。Ekici等[28]在研究花青素提取的温度、时间和pH条件时,发现样品中的花青素含量在pH3～7的范围内随pH上升而下降。Kang等[29]在研究黑米花青素提取的优化工艺时也发现70%(v/v)酸化后的乙醇有最高的花青素提取浓度461.72 mg/L,说明提取液的pH影响花青素的得率。Loypimai等[30]研究来自黑米糠的花青素稳定性时也发现高温和高pH将导致花青素的降解。本试验在以无水乙醇为提取溶剂时,发现影响黑米花青素得率的主要因素是pH,然后依次为提取时间,液料比,乙醇体积分数和温度,再次证明控制提取液pH对花青素得率的重要性。

提取溶剂对黑米花青素的提取工艺有较大影响。He等[31]用水为提取溶剂研究大规模提取黑米花青素工艺时发现,料液比1∶12,提取温度为50 ℃,提取时间为80 min,提取液pH为3.2时效果最佳。郭梅等[17]以黑米为原料,利用乙醇为浸提剂,研究黑米色素的提取工艺,其最佳工艺为乙醇体积分数95%,料液比1∶45 (g∶mL),浸提pH3.0,浸提温度80 ℃,浸提时间90 min;提取pH和温度均较高,提取时间较长。Pedro等[20]用乙醇和1.0 mol/L的柠檬酸以80∶20的比例组成的混合液为溶剂,研究黑米花青素的最佳提取工艺后认为提取温度为34.7 ℃,提取时间为80 min,料液比为1∶30,花青素得率为1.17 mg/g,但该研究没有考查pH。

本试验确定以乙醇为溶剂提取黑米花青素的最佳工艺条件为:乙醇体积分数为80%,提取时间为60 min,提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g∶mL),提取液pH为1;其黑米首次提取液花青素含量可达34.34 μg/mL。该工艺的提取温度及料液比与侯召华等[9]、张福娣等[32]及钟岩等[1]相近,但提取温度更低,液料比更小,有利于节省药品以及降低花青素的损失;提取液pH与钟岩等[1]的试验结果相同,均为1,由于pH<2时,花青素主要以2-苯基苯并吡喃阳离子的结构稳定存在,所以本试验所用pH为花青素的稳定提供了一定的保障。因此,黑米花青素提取的关键控制因素是提取液pH。针对不同的提取溶剂,优化黑米花青素的提取工艺,将有利于黑米花青素的工业化生产,提高黑米的附加值,扩大水稻产业发展路径。

4 结论

本研究通过单因素和正交设计综合分析后认为黑米花青素的优化工艺为:乙醇体积分数为80%,提取时间为60 min,提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g∶mL),提取液pH为1;该工艺的黑米首次提取液的花青素含量可达34.34 μg/mL。最佳提取次数为3次,其花青素相对总提取率达到99.29%,花青素得率为298.23 μg/g。该工艺的提取温度更低,液料比更小,从而更节省药品和被破坏的花青素更少。通过文献对比后认为黑米花青素提取的关键控制因素是提取液pH。