去除脱氧雪腐镰刀菌烯醇乳酸菌的筛选及其作用条件

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(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名呕吐毒素,化学名称为3,7,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮,是一种单端孢霉烯族化合物[1]。呕吐毒素是镰刀菌属的次级代谢产物[2],主要产生菌为禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌,广泛存在于污染的小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物和饲料中[3]。近年来研究显示,国内饲料原料霉菌毒素污染超标率高达60%～70%[4-6]。呕吐毒素污染的谷物,其活性及营养成分含量大幅度降低。当饲料或者粮食中的DON含量超过1 mg/kg时,会对人和动物的健康产生危害,例如厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状,严重时损害造血系统,造成死亡[7]。因此,如何有效防控和降解饲料和食品中的呕吐毒素始终是畜牧业和食品工业亟待解决的科学难题。

目前国内外去除真菌毒素主要有物理、化学和生物方法三大类。物理方法包括热处理、研磨去壳、辐照法等。物理方法对DON的清除不够彻底,容易造成二次污染,并且要在很高的温度或者苛刻的条件下才能去除,成本过高,实际使用较为困难。它们主要对吸附黄曲霉毒素有效,而对DON及其他霉菌毒素无效或效果很有限。能有效地使霉菌毒素解毒或失活的化学物质有:氨气、亚硝酸钠、过氧酸、碱、臭氧溶液等[8],对DON的去除彻底迅速。但用化学方法处理谷物、饲料等原材料,不仅破坏食物的营养成分,降低适口性,甚至会引入其他有害物质。生物脱毒是利用微生物在其生长过程的代谢产物或是微生物自身的特性进行脱毒,包括微生物降解和微生物吸附。其过程温和,不需要使用有害化学试剂,不会造成营养物质大量流失[9]。因此,生物方法作为高效、安全、无污染和条件温和的处理方法成为研究的热点。目前国内外对于呕吐毒素的研究刚刚起步,研究主要集中在呕吐毒素降解菌的筛选方面。

近年来,很多研究都表明乳酸菌可以去除真菌毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯毒素、伏马菌素和展青霉素等[10-13]。乳酸菌对霉菌毒素的去除机制可能是细胞壁的吸附或者产生的代谢产物将霉菌毒素转化成另一种物质[14-15]。但目前研究最多的主要是乳酸菌对黄曲霉毒素的清除,国内关于DON的脱毒研究甚少,相关报道也不多。本实验从腌鱼、泡菜、酸马奶原材料中以及实验室保藏的菌株中筛选出能够清除DON的乳酸菌,为利用该菌株去除饲料中或发酵产品中的DON奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腌鱼 来自贵州;泡菜 来自韩国;酸马奶 来自内蒙古;DON 98%,加拿大TripleBond公司;甲醇 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;植物乳杆菌L163、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、绿色魏斯氏菌、清酒乳杆菌等菌种 由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室提供;MRS培养基:牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、吐温80 国药集团化学试剂有限公司。

TOMY-SX700立式压力蒸汽灭菌器 日本TOMY公司;SW-CJ-1D型超净工作台 苏州净化设备有限公司;Agilent 1100 series高效液相分析系统(配有可变波长紫外检测器和Instrument色谱工作站) 美国Agilent公司;Eppendorf centrifuge 5804R台式离心机 德国Eppendorf公司;UV-2600紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离 在超净工作台上取出10 g腌鱼、泡菜、酸马奶,剪碎,放入装有玻璃珠的250 mL无菌三角瓶中,倒入90 mL 灭菌的生理盐水,放置于37 ℃,180 r/min的摇床中震荡30 min后,取出,吸取1 mL培养液于装有9 mL生理盐水的试管中,涡旋仪震荡混匀,连续梯度稀释,吸取100 μL的10-3～10-6稀释度的菌悬液,均匀涂布于MRS平板上,37 ℃培养箱中倒置培养24 h。待其长出菌落后,观察菌落的颜色、大小、隆起度、边缘形态、干湿状态及透明程度等,挑取形态等表征有差别的单菌落进行分离纯化,划线接种于MRS培养基,于4 ℃冰箱保藏,用于后续的筛选。

1.2.2 乳酸菌的活化 实验室保藏菌株,从冻存的甘油管中取出,在MRS平板上划线培养,37 ℃培养箱中静置培养48 h后,挑取生长良好的单菌落接种到MRS液体培养基中静置24 h,培养温度37 ℃。然后按2%接种量将此活化后的实验菌株培养液接种到MRS液体培养基中，于温度为37 ℃的恒温培养箱中静置培养24 h,传代2次。

1.2.3 去除DON乳酸菌的初步筛选 乳酸菌活化2次后,4000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,收集菌体,用生理盐水洗涤2次,以除去培养基等成分的干扰,最后重悬于生理盐水中,调整菌体含量至1010CFU/mL以上。加入DON标准品,使得DON的终浓度为50 μg/mL,放置于37 ℃摇床中震荡培养1 h,取出后再放置于37 ℃培养箱中培养23 h。10000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,取上清,过0.22 μm滤膜,HPLC检测,计算DON去除率。

1.2.4 去除DON的乳酸菌的复筛 初筛所得去除率30%以上的菌株,菌种保藏管冻存,用于后续实验。菌株在MRS液体培养基中活化2次后,离心收集菌体,生理盐水洗涤2次后,重悬于生理盐水中,调整菌体浓度为1010CFU/mL以上,加入终浓度为50 μg/mL的DON,共培养12、24、36、48 h,并分别取出1 mL,10000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,取上清,过0.22 μm滤膜,HPLC检测,计算DON去除率。

1.2.5 乳酸菌对DON耐受力的测定 副干酪乳杆菌活化2次后,以2%的接种量分别接种于含DON 0、20、50、100、200、500 μg/mL的MRS液体培养基中,37 ℃培养箱中培养24 h,每隔2 h取样,利用分光光度计测量600 nm波长下的吸光度值。

1.2.6 菌体浓度对菌株去除DON的影响 乳酸菌活化后,4000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,收集菌体,生理盐水洗涤2次后,分别调整菌体浓度为5.0×108、1.0×109、5.0×109、1.0×1010CFU/mL以上,pH为7.0,加入DON,使其终浓度为50 μg/mL,分别放置于37 ℃培养24 h,取出1 mL,10000 r/min,4 ℃条件下离心10 min,取上清,过0.22 μm滤膜,HPLC检测,计算DON去除率。

1.2.7 温度对菌株去除DON的影响 按1.2.6方法,调整菌体浓度为1010CFU/mL以上,重悬于生理盐水中,pH为7.0,加入终浓度为50 μg/mL的DON,分别放置于25、30、33、37、40 ℃培养24 h,其它操作同1.2.6,计算DON去除率。

1.2.8 pH对菌株去除DON的影响 按1.2.6方法,调整菌体浓度为1010CFU/mL以上,分别重悬于pH为4、5、6、7、8的生理盐水中,加入DON,使其终浓度为50 μg/mL,37 ℃培养24 h,其它操作同1.2.6,计算DON去除率。

1.2.9 DON含量的检测

1.2.9.1 DON标准曲线的建立 用去离子水配置12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的DON标准品溶液,HPLC检测,建立峰面积与DON浓度之间的一元线性回归方程。根据不同浓度DON的标准品绘制标准曲线,线性方程为y=33.516x+10.986,相关系数为0.9999,表明DON的浓度在12.5～200 μg/mL范围内,与对应的峰面积之间具有良好的线性关系。

1.2.9.2 色谱条件 色谱柱为:Aligent 5 HC-C18(2)250 mm×4.6 mm。流动相为甲醇∶水=30∶70,流速为0.6 mL/min,紫外检测器,检测波长218 nm,进样量20 μL,柱温25 ℃。

1.2.9.3 去除率的计算 以不接菌含有DON的生理盐水为空白对照组,接菌含有DON的生理盐水为实验组,在相同条件下培养相同时间。

式中A:空白组DON的含量,B:实验组DON的含量。

1.3 数据处理

Excel 2013进行数据分析和绘图,采用SPSS Statistics 22进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 去除DON的乳酸菌的初步筛选

利用共培养的方式,从150株乳酸菌中初步筛选出32株能够清除DON的乳酸菌,结果如图1所示。不同的菌株对DON的去除能力因菌株间差异而各不相同,去除率在15%～40%,选择去除率在30%以上的乳酸菌Y-30、Y-35、Y-31、Y-33、D-8、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行复筛。

图1 乳酸菌对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的去除率的影响Fig.1 Influence of lactic acid bacteria on the removal rate of deoxynivalenol注:菌株编号“Y”表示菌株来源于腌鱼;“P”表示菌株来源于泡菜;“D”表示菌株来源于酸马奶。已知名称的菌株来源于本研究室所保藏菌株。(表1同)。

2.2 去除DON的乳酸菌的复筛

对2.1中得到的7株菌株进行复筛,并分别测定12、24、36、48 h下DON的去除率,复筛的结果见表1。随着时间的延长,DON的去除率会有所变化,且不同菌株变化不一致。大部分的菌株在24 h时去除率达到最大值,36 h后去除率有所降低,可能是部分被吸附的DON又重新释放到了体系中。鼠李糖乳杆菌对DON的去除效果最好,这和Turner P C[16]等的研究结果一致。但鉴于目前关于该菌株的研究较多,且副干酪乳杆菌对DON的去除率也较高,在24 h时可以清除40.1%的DON,因此选择副干酪乳杆菌进行下一步研究。Franco等[17]研究发现，经高温灭活后的副干酪乳杆菌去除DON的能力比活菌提高了一倍多,并且副干酪乳杆菌的发酵上清液能有效抑制禾谷镰刀菌IAPAR 2218的生长。鉴于副干酪乳杆菌对DON的高效去除能力,以及国内关于副干酪乳杆菌去除DON的研究尚未报道,因此本文选择副干酪乳杆菌做后续实验研究。

表1 去除DON的乳酸菌的复筛Table 1 Rescreening of DON removal capability of lactobacillus

根据不含副干酪乳杆菌菌体的对照组的HPLC图(图2A)可知,DON的出峰时间时11.4 min左右。对比对照组和实验组DON的峰面积(图2B),发现实验组的峰面积有明显下降,由液相图可以直观地看出副干酪乳杆菌对DON有去除效果。

图2 副干酪乳杆菌去除DON的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of DON removal ability of Lactobacillus paracasei注：A：不加菌体的空白对照;B：加入菌体的共培养体系。

2.3 副干酪乳杆菌对DON的耐受力

由于呕吐毒素对细胞有一定的毒害作用,因此乳酸菌对DON的高耐受能力是应用于实际的前提条件。

结果表明(图3),低浓度(0～20 μg/mL)的呕吐毒素含量对乳酸菌的生长没有太大的抑制作用,浓度为20 μg/mL的DON的生长情况与不加DON的空白组生长情况基本吻合。浓度分别为50、100 μg/mL的DON对乳酸菌的生长有轻微的抑制,并且在12 h以前,影响作用不大,在12 h后,生长变得有所缓慢。由此可见乳酸菌对中低浓度的DON有一定的耐受能力。对于高浓度的DON(200 μg/mL),菌体生长缓慢,抑制生长作用较明显。龚雪[18]研究乳酸菌LB-11对展青霉素的耐受力时,发现在含有不同浓度展青霉素的培养基中,该乳酸菌的生长并没有受到影响,生长曲线与空白组几乎重合。这种对DON的高耐受力和去除能力，为利用该菌株去除禾谷原料或发酵产品中的DON奠定基础,有利于保证人畜的食品和饲料安全。

图3 副干酪乳杆菌对DON耐受力Fig.3 DON tolerance capbility of lactobacillus paracasei

2.4 菌体浓度对副干酪乳杆菌去除DON效果的影响

菌体浓度的增加对DON的脱毒效果具有明显的促进作用(图4)。随着菌体浓度的升高,副干酪乳杆菌对DON的去除率逐渐增加,当菌体浓度为1.0×1010CFU/mL,去除率高达40%左右。由此可以看出,乳酸菌菌体浓度对DON去除率的影响很大。这可能是由于菌体浓度增多,能够吸附的DON含量越多。刘畅[19]、骆翼[20]研究益生菌对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的脱毒效果时发现,随着菌体量的增加,去除效果也越高,与本文研究结果一致。

图4 不同菌体浓度下副干酪乳杆菌对DON去除率的影响Fig.4 Influence of bacterial concentration on DON-removing-capacity by lactobacillus paracasei注:不同字母代表组间差异显著(p<0.05)；图5～图6同。

2.5 温度对副干酪乳杆菌去除DON效果的影响

温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。过高的环境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活,而过低的温度会使酶活力受到抑制,细胞的新陈代谢活动减弱。本研究中,在较低温度25、30 ℃时,去除率在15%左右,而随着温度的升高,去除率增加,在37 ℃时,去除率达到最大值35.39%。因此,37 ℃为最适温度。杨史良[21]研究发现益生菌清除DON的最适温度为37 ℃,崔玉琦[22]筛选出一株对黄曲霉毒素有降解效果的芽孢杆菌时,发现在37 ℃的温度下,去除能力最大,可能由于该菌是从肠道中筛选出来的,而动物肠道温度一般为37 ℃左右。

图5 不同温度下副干酪乳杆菌对DON去除率的影响Fig.5 Influence of temperature on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

2.6 pH对副干酪乳杆菌去除DON效果的影响

环境pH对微生物的生命活动有很大的影响,同时还影响了细胞表面的电荷分布。在研究过程中发现,pH对DON去除率影响较大,在较低pH4、5时,去除率低,在20%左右,随着pH的升高,去除率增加,在pH7时,去除率达到最大值40.4%(图6)。最适pH也因菌株、毒素差异而各有不同。Zhao等[23]在研究乳杆菌清除黄曲霉毒素B1去除机理时,发现pH3时,去除率达到最高。龚雪[18]在研究乳酸菌LB-11去除展青霉毒素时,发现pH3～7时,去除能力都较高。

图6 不同pH下副干酪乳杆菌对DON去除率的影响Fig.6 Influence of pH on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

3 结论

本研究筛选出了一株能够清除DON的副干酪乳杆菌,目前国内尚未有相关报道。在DON终浓度为50 μg/mL的体系中,去除率在24 h达到40.1%。同时,对副干酪乳杆菌的脱毒条件进行了研究,包括菌体浓度、pH、反应温度。研究发现,当菌体浓度达到1010CFU/mL以上时,在反应温度为37 ℃,pH为7的条件下,去除率达到最大值。利用乳酸菌能够去除DON的特性,可以将其用于食品或者饲料的发酵,既可以提高食品的安全性,也可以提高食品的营养价值,改善食品风味,同时节约成本,具有潜在的应用前景。