水飞蓟宾对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制

高 歌，范义增，淡炜超，任加强，白欣姗，栾嘉欣，曾 津

(西安交通大学：1.第一附属医院泌尿外科；2.医学部，陕西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)在世界范围内的发病率逐年上升，位居我国男性恶性肿瘤的第6位[1]，在欧美等发达国家位居第1位[2]。前列腺癌生长具有雄激素依赖性，通过手术和药物等方式阻断雄激素对前列腺癌患者具有良好的治疗效果，但大多数患者会从雄激素依赖型前列腺癌进展为去势抵抗型前列腺癌，侵袭性增加且预后极差。因此，继续寻找新型有效的前列腺癌治疗方式仍然是需要努力研究的方向。

水飞蓟宾是从水飞蓟种子中提取所得的活性成分[3-4]，越来越多的研究发现，水飞蓟宾可以作用于恶性肿瘤细胞增殖、能量代谢、血管生成和炎症反应等，从而发挥抗肿瘤的作用。我们研究团队前期发现水飞蓟宾在抑制前列腺癌侵袭转移中发挥重要功能[5-6]，然而对于水飞蓟宾能否通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERs)调节前列腺癌细胞增殖、凋亡尚未可知。本实验旨在探究水飞蓟宾通过激活内质网应激调节前列腺癌细胞增殖、凋亡，以期找到水飞蓟宾治疗前列腺癌的新机制。

1 材料与方法

1.1材料人前列腺癌细胞株PC-3、C4-2购自美国ATCC细胞库；RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；水飞蓟宾和四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；RNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；兔抗人Caspase 3/Cleaved-Caspase 3、Caspase 12/Cleaved-Caspase 12、BiP/GRP78抗体购自美国CST公司；兔抗人IRE-1和JNK购自美国abcam公司；β-ACTIN抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2细胞培养人前列腺癌细胞PC-3、C4-2接种于含10%胎牛血清和双抗溶液(青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL)的RPMI1640培养基中，细胞呈贴壁生长，放置在37 ℃、含5%CO2培养箱中进行常规培养，每隔2～3 d细胞换液。当细胞生长至70%～80%左右时，用0.05%胰酶消化，收集离心并重悬细胞，传代继续培养。

1.3细胞MTT实验收集对数生长期PC-3、C4-2细胞，按照细胞密度5×103个/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养过夜，待细胞贴壁后加入不同浓度的水飞蓟宾(0、25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)处理细胞，每组设5个复孔。继续培养24/48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL,继续培养4 h。弃去上清液后每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使结晶物充分溶解，490 nm波长处测定吸光度，计算细胞存活率。

1.4平板克隆实验收集对数生长期PC-3、C4-2细胞，以1 000个/孔的密度接种于6孔板中培养，分别加入不同浓度的水飞蓟宾(0、100、150、200 μmol/L)，放置于37 ℃、含5%CO2培养箱中继续培养1周。终止培养后使用4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS清洗3遍后加入0.1%结晶紫染色液染色20 min，缓慢冲洗洗去染色液，空气干燥后用肉眼直接计数克隆，计算克隆形成率。克隆形成率%=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.5Westernblot分析前列腺癌细胞PC-3、C4-2接种于6孔板，培养至细胞贴壁后分别加入不同浓度的水飞蓟宾(0、100、150、200 μmol/L)处理24 h，PBS缓冲液冲洗3次并收集细胞，加入蛋白裂解液离心15 min，提取上清总蛋白。留取10 μL上清液进行蛋白定量，其余上清加入6×Loading buffer在沸水中煮沸5 min。每组取20 μg蛋白进行SDS-聚丙烯胺凝胶电泳，蛋白分离后电转移至PVDF滤膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h；加入一抗放置于4℃摇床过夜，次日TBST洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记对应二抗室温孵育1 h， TBST洗膜3次，使用ECL进行显色，Image lab分析软件对显色条带进行分析。目的蛋白表达量通过与内参蛋白β-ACTIN标准化后得到相对比值。

2 结 果

2.1水飞蓟宾对前列腺癌细胞增殖能力的影响前列腺癌细胞C4-2和PC-3接种于96孔板，使用不同浓度(0、25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)水飞蓟宾处理细胞24 h，四甲基偶氮唑蓝(MTT)结果发现，与对照组相比水飞蓟宾抑制C4-2(图1A)和PC-3(图1B)细胞增殖且呈浓度依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。使用SPSS 18.0统计分析测得对C4-2和PC-3细胞半数抑制浓度(IC50)分别为112.484 μmol/L和139.501 μmol/L，依据IC50分别选择50、100、150 μmol/L和100、150、200 μmol/L处理C4-2和PC-3细胞。

图1不同浓度水飞蓟宾处理前列腺癌细胞24h时MTT检测C4-2及PC-3细胞存活率的变化

A：C4-2；B：PC-3。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飞蓟宾抑制前列腺癌细胞增殖呈浓度依赖性)。

2.2水飞蓟宾抑制前列腺癌细胞的平板克隆形成在MTT实验发现水飞蓟宾抑制前列腺癌细胞增殖活性后，我们又通过平板克隆实验进一步验证水飞蓟宾对于前列腺癌细胞增殖能力的影响。分别使用0、50、100、150 μmol/L和0、100、150、200 μmol/L的水飞蓟宾处理C4-2(图2A、B)和PC-3(图2C、D)细胞1周，与对照组相比，水飞蓟宾处理组前列腺癌细胞克隆形成能力减弱，平板克隆细胞数目减少、体积减小，抑制作用与浓度呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2平板克隆形成实验检测不同浓度水飞蓟宾对C4-2细胞及PC-3细胞克隆形成能力及数目

A：C4-2细胞克隆形成能力；B：C4-2细胞克隆形成数目；C：PC-3细胞克隆形成能力；D：PC-3细胞克隆形成数目。对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飞蓟宾抑制前列腺癌细胞平板克隆形成)。

2.3水飞蓟宾促进前列腺癌细胞凋亡实验组水飞蓟宾处理前列腺癌细胞24 h，检测Caspase 3/Cleaved-Caspase 3和Caspase 12/Cleaved-Caspase 12蛋白改变，与对照组相比水飞蓟宾上调C4-2(图3A、3B)和PC-3细胞(图3C、D)Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12蛋白水平，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3Western-blot检测C4-2细胞、PC-3细胞中Caspase3/Cleaved-Caspase3和Caspase12/Cleaved-Caspase12蛋白表达改变及其柱状图(蛋白灰度值相对内参比值变化)

A、B:分别为C4-2细胞蛋白表达改变的电泳图及其柱状图；C、D：分别为PC-3细胞蛋白表达改变的电泳图及其柱状图。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(水飞蓟宾促进Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12表达)。

2.4水飞蓟宾激活前列腺癌细胞内质网应激的发生本研究发现水飞蓟宾可以抑制前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡，但分子机制未知。内质网应激与增殖和凋亡之间存在密切联系，激活内质网应激促进细胞凋亡的发生，因此我们猜想水飞蓟宾通过影响内质网应激过程调节前列腺癌增殖和凋亡。使用不同浓度的水飞蓟宾处理C4-2细胞及PC-3细胞24 h后，通过Western blot方法检测C4-2细胞及PC-3细胞中内质网应激蛋白BiP、IRE1和JNK表达变化，结果发现随着水飞蓟宾浓度的增加，C4-2细胞(图4A、B)及PC-3细胞(图4C、D)内质网应激蛋白BiP、IRE1和JNK的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4Western-blot检测C4-2细胞、PC-3细胞中BiP、IRE1和JNK蛋白水平变化及其柱状图(蛋白灰度值相对内参比值变化)

A、B:分别为C4-2细胞蛋白表达改变的电泳图及其柱状图；C、D：分别为PC-3细胞蛋白表达改变的电泳图及其柱状图。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨 论

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，具有复杂的生物学行为。部分恶性程度低的前列腺癌患者可以长期带瘤生存，而部分高度恶性的前列腺癌患者病情进展迅速、发生广泛转移[8]。雄激素去势治疗(androgen deprivation therapy，ADT)是目前前列腺癌临床最常用的治疗手段之一，但大部分患者最终进展为去势抵抗性前列腺癌，因缺乏有效治疗手段而最终死亡，平均生存期只有12～18月[9]。目前，虽然在全球范围内存在一些针对CRPC患者的治疗药物和措施，但其疗效仍不理想。近年来我国前列腺癌的发病率逐渐升高，已经成为威胁我国老年男性健康的重要杀手之一。

水飞蓟素是从菊科植物水飞蓟中提取出来的黄酮类化合物，其有效成分水飞蓟宾具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗肝纤维化等多种作用[10]，是优良的保肝类药物。近年来，水飞蓟宾在肿瘤中的作用越来越引起人们重视，研究发现水飞蓟宾在乳腺癌[11]、肝癌[12]、肾癌[13]、膀胱癌[14]以及前列腺癌[15]等中发挥重要的抗癌作用。本研究重点探讨水飞蓟宾在前列腺癌中抑制增殖及促进凋亡的作用，并探讨其分子机制。体外实验通过使用不同浓度梯度水飞蓟宾处理前列腺癌细胞C4-2和PC-3，使用MTT实验和平板克隆实验发现其抑制前列腺癌增殖，并呈浓度依赖性。同时使用水飞蓟宾处理细胞，通过Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3/Cleaved-Caspase 3、Caspase 12/Cleaved-Caspase 12表达，发现随着药物浓度增加，Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12表达上调，说明水飞蓟宾促进前列腺癌细胞凋亡并呈浓度依赖性。

内质网(endoplasmic reticulum,ER)作为真核细胞中重要的细胞器，具有介导蛋白质合成、成熟与分泌的重要功能。在多种条件下，如缺氧、饥饿、高脂饮食、钙离子流失等会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网的聚集，引起内质网正常生理功能的紊乱，称为内质网应激(ER stress，ERs)[16]。正常情况下，内质网通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)来保护细胞免受ERs引起的损伤，然而当严重或持续性ERs存在时，会诱导细胞凋亡发生而导致细胞死亡[17]。ERs主要由内质网分子伴侣蛋白GRP78/BiP和3个应激感受蛋白PERK、ATF6和IRE1所介导，ERs不存在的情况下分子伴侣GRP78/BiP与3个应激感受蛋白结合，应激感受蛋白处于失活状态；当ERs存在时，GRP78/BiP与3个应激感受蛋白解离从而引起UPR发生。本研究使用不同浓度水飞蓟宾处理细胞，通过Western blot检测GRP78/BiP蛋白表达，发现水飞蓟宾引起GRP78/BiP蛋白表达明显升高。

IRE1是介导ERs和细胞凋亡过程中关键的信号分子，通过激酶作用与肿瘤坏死因子受体相关因子 2(TNF receptor associated factor,TRAF2)和凋亡信号调节激酶(TNF-dependent apoptosis-signaling kinase 1，ASK1)形成TRAF2-ASK1-JNK 复合体，激活JNK信号通路，丝裂原活化蛋白激酶JNK通过调节凋亡相关基因Bcl-2介导细胞凋亡发生[18]。在本研究中通过Western blot检测发现随着水飞蓟宾药物浓度增加，IRE1和JNK蛋白表达明显上调，这可能是水飞蓟宾介导前列腺癌细胞凋亡的重要分子机制。

综上所述，水飞蓟宾能够明显抑制前列腺细胞增殖并促进其凋亡发生，激活内质网应激信号通路是其可能的分子机制之一。