舒筋活络药祛风湿药性理论的实验研究

张小丽，陈瑞明，李 芳，范引科，姜姗姗，张 涛，张明发

(1.陕西省中医药研究院，西安 710003；2.清华德人西安幸福制药有限公司，西安 710043)

用现代药理学研究的手段建立中药药性研究的基本思路就是对中药性、味、归经三者结合的药性内涵的研究。运用数据的量化和达标的处理办法，探讨5味舒筋活络药祛风湿抗变态反应性炎症和抗骨质疏松等多个方面的药理作用，以药效谱表示同一性味归经药的共同药理活性，使中药药性概念量化、具体化和现代化。舒筋活络药大多入肝、肾经，有的归肝经，味多辛、苦，药性偏温，本实验旨在研究它们共同的药效谱。

1 仪器和材料

1.1仪器 DEXM双能X线骨密度仪(美国GE公司)；迈瑞BS-300全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；SC-50电解质分析仪成套校正液(上海迅达医疗仪器有限公司；产品标准号：YZB/沪2581-40-2010)；迅达XD-685电解质分析仪，GC-2016放射免疫计数器(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；KDC-2044低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；小动物骨骼强度仪(山东医学科学院设备供应维修站)；TDM系列马弗炉(温州市双屿仪表厂，许可证号03200159)；BS210S电子分析天平(d=0.1 mg，北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2试药 维甲酸(批号46306C，阿达玛斯试剂有限公司)；羧甲基纤维素钠(批号F20110001，天津爱勒易医药材料有限公司)；钼酸铵(批号20150410，上海科兴生物科技有限公司)；酒石酸锑钾(EINECS号2342933，上海实验试剂有限公司)；碘骨钙素放射免疫分析药(北京北方生物技术研究所)；F5881-10 mL，SLBB9819，CAS 9007-81-2弗氏完全佐剂(Sigma公司)；仙灵骨葆(批号Z20025337，贵州同济堂制药有限公司)；醋酸地塞米松片(批号1204073，国药准字H12020686，天津天药药业股份有限公司)。

1.3动物 9月龄雌性SD 大鼠，体质量220～280 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物级别：SPF，动物许可证号：SCXK(陕)2012-003，分笼饲养在20～25 ℃、相对湿度为60%～80%的清洁环境中，自由饮水、摄食。

2 方法

2.1实验用药 木瓜、豨签草、桑枝、络石藤和海风藤5味中药材均由李芳研究员鉴定。将药材用10倍量水微沸煎煮 3次，每次0.5 h，合并提取液，在水浴上浓缩成质量浓度为1 g·mL-1，供实验用。

2.25味中药对大鼠维甲酸引起骨质疏松的改善作用

2.2.1造模及给药 将大鼠按照体质量随机分为8组：水对照组、仙灵骨葆阳性对照组、模型组、木瓜给药组、豨签草给药组、桑枝给药组、络石藤给药组和海风藤给药组，每组10只。给药方法及剂量：水对照组每天上午和下午分别灌胃1 mL·kg-1蒸馏水；模型组：每天上午用80 mg·kg-1维甲酸(先将羧甲基纤维素钠与蒸馏水配制成质量浓度为10 g·L-1的均匀溶液，后加入维甲酸配制成80 mg·kg-1的混悬溶液)灌胃，下午用等体积蒸馏水灌胃；仙灵骨葆阳性对照组：每天上午用80 mg·kg-1维甲酸灌胃，下午用1 g·kg-1仙灵骨葆灌胃；5味给药组：上午用80 mg·kg-1维甲酸灌胃，下午用木瓜、络石藤、豨签草、桑枝和海风藤各药材浸膏按照剂量分别为15，7.3，15，15和15 g·kg-1配液灌胃。每组维甲酸灌胃15 d，给药45 d，15 d内边造模边给药，15 d后只给药不造模，水对照组和模型组给予等体积蒸馏水[1-5]。

2.2.2检测 各组大鼠在处死前2 d采用美国GE公司生产的双能X线骨密度仪(变异系数≤1.0%)扫描其全身骨骼的骨密度并作记录[6]。处死时取血分成A和B 2份，采用KDC-2044低速冷冻离心机以3 500 r·min-1离心15 min，取上层血清备用，取大腿两侧股骨和腰椎，及时剔除其软组织，用体积分数为10%的甲醛溶液浸泡，取左侧股骨在干燥箱中90 ℃烘干2 h，称定质量，测量周长后采用小动物骨骼强度仪测量左腿股骨的骨折力，电炉上炭化，置于马弗炉中800 ℃灰化2 h，冷却至室温，称定质量，置于干燥箱中。

血清A用生化方法采用钼酸铵和酒石酸锑钾检测血清中Ca、P和ALP的含量[7]；血清B用放射免疫方法采用放射免疫计数器和碘骨钙素放射免疫分析检测血清中骨钙素的质量浓度。

2.35味中药对大鼠佐剂性关节炎的影响

2.3.1造模及给药 取SD大鼠80只，随机分为8组，分别为水对照组、醋酸地塞米松阳性对照组、模型组、木瓜给药组、豨签草给药组、桑枝给药组、络石藤给药组以及海风藤给药组，每组10只。给药方法和剂量：于每只大鼠左侧后足跖皮内处注射弗氏完全佐剂，每只0.1 mL，诱导大鼠类风湿性关节炎模型[8-11]。每组大鼠于造模后第1天开始灌胃给药，醋酸地塞米松阳性对照组灌胃给予醋酸地塞米松溶液，模型组灌胃给予蒸馏水，其他7组分别给予10味中药水提物配制溶液，给药量均为10 mL·kg-1，每日灌胃1次，连续给药25 d。

2.3.2观测指标

2.3.2.1观察大鼠注射部位和非注射部位的炎症反应 大鼠注射足的肿胀度即急性免疫反应和非注射部位(后足、前足、耳、鼻和尾巴)出现的继发性炎症病变。

2.3.2.2足肿胀的测定 致炎前分别测量并记录各组大鼠左、右后足的足踝周长(用线绳绕足踝处缠2圈测周长，以减小误差)，致炎后密切观察足肿胀情况，分别于致炎后第1，6，8，11，18和25 d分别测量并记录各组大鼠左后足的足踝周长，以同侧足跖致炎前后的足踝肿胀度为观察指标，观察治疗药物对大鼠佐剂性关节炎的影响，计算大鼠左后足踝肿胀度(肿胀度=致炎后足跖周长-致炎前足跖周长)。

2.3.2.3关节指数(AI)的评定 于最后一次测量足肿胀前(致炎后第24天)，进行关节指数评定：0分：无关节炎；1分：有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节部位中度肿胀；3分：严重肿胀；4分：严重肿胀且不能负荷[11-12]。

2.3.2.4免疫器官指数 于致炎后第26天处死大鼠，解剖，分别取出肝脏、胸腺和脾脏，称定质量(脏器称定质量前必须把其他组织分离干净，以减小误差)，计算脏器指数(脏器指数=器官质量÷体质量×100%)。

2.3.2.5血清细胞因子的检测 大鼠麻醉，仰位固定，颈动脉采取3 mL全血，分离血清，-80 ℃保存，按照EL1SA试剂盒说明书操作，计算TNF-α和IL-2的质量浓度[13]。

3 结果

3.1对骨质疏松大鼠的影响

3.1.1一般症状观察 维甲酸模型组初期，模型组大鼠逐渐出现眼角出血、皮毛无光泽、活动量减少和食欲下降等症状；同时，部分大鼠出现腹泻、下颚和腹部脱毛严重、大鼠反应速度降低。给药组与模型组比较，上述症状均较轻；且在停止灌胃维甲酸后1周，5组给药组与模型组比较上述症状好转趋势较为明显。水对照组皮毛光泽较好，活动正常。

3.1.2对体质量的影响 维甲酸灌胃1周后，与水对照组比较，模型组与5组给药组的大鼠体质量均下降，但模型组下降趋势较快；给药3周后，所有大鼠体质量均有上升，5组给药组均较模型组上升趋势快，但差异无统计学意义。

3.1.3对各组大鼠骨密度的影响 与水对照组比较，模型组股骨、腰椎骨(BMD)明显降低(P<0.05，P<0.001)，说明维甲酸诱导骨质疏松模型建立成功；与模型组比较，5味药大鼠股骨、腰椎骨(BMD)明显增加(P<0.05，P<0.001)，有3味药达++以上。见表1。

表15味舒筋活络药对大鼠骨密度的影响

组别剂量/g·kg-1动物数/只左股骨BMD/g·cm-2增长率/%作用强度右股骨BMD/g·cm-2增长率/%作用强度腰椎骨BMD/g·cm-2增长率/%作用强度水对照组100.20±0.02*4.000.22±0.02**16.0++0.20±0.02***25.0++模型组100.19±0.010.000.19±0.010.000.19±0.020.00仙灵骨葆对照组190.23±0.02***22.0+++0.20±0.01***16.0++0.20±0.02**10.0++木瓜给药组15100.21±0.02**8.0+0.22±0.02**10.0++0.21±0.02*8.0+络石藤给药组7.390.22±0.02**13.0++0.21±0.02*8.0+0.22±0.03*13.0++豨签草给药组1590.22±0.02**12.0++0.20±0.01***10.0++0.22±0.02*12.0++桑枝给药组15100.20±0.013.000.21±0.02**8.0+1.22±0.024.00海风藤给药组1590.22±0.02*10.0++0.21±0.01**6.0+2.22±0.02*11.0++

注：与水对照组比较*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；按照作用强度等级划分： <5%为0；5%～10%为+；10%～15%为++；>15%为+++。以++以上为该项药效有价值。

3.1.45味药对大鼠股骨抗骨折能力的影响 与水对照组比较，模型组股骨骨折力强度明显较低(P<0.05)；与模型组比较，只有豨签草作用强度达+++。见表2。

3.1.55味药对血清Ca、P和ALP水平的影响 对血清Ca浓度的影响：5组给药组血钙含量无明显变化，且作用强度低；对血清P浓度的影响：舒筋活络药血清P浓度显著升高，且作用强度较高，5味药均达标；对血清ALP浓度的影响：木瓜、豨签草作用强度达标。见表3。

3.1.65味药对大鼠股骨灰分的影响 水对照组和5组给药组股骨灰分含量均稍高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，且5味舒筋活络中药作用强度较高，均达++以上，说明通过药物调节骨中的矿物质含量增加。见表4。

3.1.75味药对大鼠骨钙素的影响 木瓜与豨签草给药组骨钙素含量明显高于模型组，作用强度达到++以上。见表5。

表25味舒筋活络药对大鼠股骨骨折力的影响

注：与水对照组比较*P<0.05；按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

表35味舒筋活络药对骨质疏松大鼠血清Ca、P和ALP水平的影响

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

表45味舒筋活络药对大鼠股骨灰分的影响

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

3.25味药对大鼠佐剂性关节炎的影响

3.2.1对大鼠体质量的影响 实验结果表明，5味舒筋活络药对佐剂关节炎大鼠的体质量无明显影响。

3.2.2对大鼠致炎侧足肿胀的影响 佐剂性关节炎大鼠致炎后15 h，致炎侧足肿胀达高峰，表现为早期的炎症反应，持续2～3 d逐渐减轻，7～8 d后再度肿胀，继发病变于致炎后10 d左右出现，表现为踝关节对侧和前足肿胀，且进行性加重，大鼠行动不便，从佐剂性关节炎大鼠于致炎后1，6，8，11，18和25 d致炎侧踝关节肿胀度看：各味药均具有抑制大鼠致炎侧足肿胀的作用，且作用强度均达标++以上。见表6。

3.2.3对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的影响 舒筋活络药对大鼠佐剂性关节炎指数均具有较强抑制作用。见表7。

表55味舒筋活络药对大鼠骨钙素(BGP)的影响

组别剂量/g·kg-1动物数/只BGP水平/ng·mL-1变化率/%作用强度水对照组101.26±0.060模型组101.40±0.290仙灵骨葆对照组192.09±0.75*48.9+++木瓜给药组15101.70±0.3721.1++络石藤给药组7.391.67±0.4219.1+豨签草给药组1591.57±0.2311.7+桑枝给药组15101.77±0.5726.2++海风藤给药组1591.67±0.5619.1+

注：与模型组比较*P<0.05。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

表65味舒筋活络药对佐剂性关节炎大鼠致炎侧足肿胀的影响

组别剂量/g·kg-1各组大鼠不同时间(d)的左足肿胀度/cm168111825平均抑制率/%作用强度模型组1.01±0.291.26±0.391.33±0.421.32±0.321.49±0.291.55±0.300木瓜给药组150.98±0.161.01±0.121.02±0.251.11±0.221.22±0.20*1.01±0.18**34.3+++豨莶草给药组151.04±0.060.92±0.29*0.97±0.23*1.02±0.19*1.06±0.20**0.96±0.18**37.8+++桑枝给药组151.12±0.231.04±0.301.14±0.291.21±0.301.27±0.291.09±0.27**29.2++海风藤给药组151.20±0.281.12±0.261.16±0.261.17±0.271.21±0.311.22±0.4721.3++络石藤给药组7.30.99±0.131.14±0.371.03±0.361.17±0.361.18±0.351.21±0.38*22.0++地塞米松组101.07±0.170.40±0.17**0.30±0.13**0.40±0.20**0.40±0.18**0.20±0.14**87.1+++

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

表75味舒筋活络药对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的影响

组别剂量/g·kg-1大鼠关节指数平均抑制率/%作用强度模型组 2.3±0.50木瓜给药组151.0±0.0***58.3+++豨莶草给药组151.3±0.5**45.8+++桑枝给药组151.5±0.5*37.5+++海风藤给药组151.8±0.425.0++络石藤给药组7.31.2±0.6**50.0+++地塞米松组100.7±0.570.8+++

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

3.2.4对佐剂关节炎大鼠免疫器官指数的影响 结果无明显影响。

3.2.5对大鼠血清细胞因子的影响 与模型组比较，各给药组大鼠血清中抗炎因子IL-2的水平显著提高(P<0.01，P<0.001)；各给药组大鼠血清中促炎因子TNF-α显著降低(P<0.05，P<0.001)。见表8和表9。

3.2.6大鼠非注射部位的观察 观察模型组大鼠发现，11～12 d在非注射部位(右后足)有明显红色斑点出现并伴有中度肿胀，足趾关节间出现关节肿大。

表85味舒筋活络药对佐剂性关节炎大鼠血清促炎因子TNF-α的影响

组别剂量/g·kg-1TNF-α水平/pg·mL-1变化率/%作用强度模型组74.67±20.040地塞米松组1034.14±29.48*54.3+++木瓜给药组1552.34±26.9529.9++豨莶草给药组1553.49±33.4828.4++桑枝给药组1542.79±29.9542.7+++海风藤给药组1542.20±31.9943.5+++络石藤给药组7.342.06±20.2343.7+++

注：与模型组比较，*P<0.05。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

表95味舒筋活络药对佐剂性关节炎大鼠血清抗炎因子IL-2的影响

组别剂量/g·kg-1IL-2水平/pg·mL-1变化率/%作用强度模型组4.82±1.510地塞米松组101.70±1.09**64.7+++木瓜给药组153.24±2.0232.8+++豨莶草给药组151.64±2.79*66.0+++桑枝给药组153.22±3.0433.2+++海风藤给药组152.53±2.17*47.5+++络石藤给药组7.32.22±2.03*53.9+++

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。按照作用强度等级划分：<10%为0；10%～20%为+；20%～30%为++；>30%为+++。以++以上为该项药效有价值。

4 讨论

研究中药药性的基本思路：对同一类中药进行研究，找它们的共同药理作用，即对中药性、味、归经三者结合的药性内涵的研究。本实验研究维甲酸致大鼠骨质疏松作用和对大鼠佐剂关节炎的影响，观察5味药的药理作用，研究其中药药性。祛风湿中药除了舒筋活络这一大类外，还有祛风湿止痛药和祛风湿强筋骨药，为了更加全面地研究祛风湿药的药性，还进行了其他祛风湿止痛药、祛风湿强筋骨药和辛温(热)合归脾胃经药的祛风湿的药性理论研究[14-15]，以全面总结祛风湿药共同的药效谱。

风湿痹证是风寒湿邪侵袭人体，滞留经络、肌肉、筋骨和关节等处，闭阻气血，继而引起肢体疼痛、酸楚、麻木、关节屈伸不利甚至肿大变形。舒筋活络药多入肝、肾经，有的归肝经，味多辛、苦，药性偏温，其温能散寒，辛能祛风，苦能燥湿，这类药行血止痛，主风寒湿邪阻滞经络，气血运行不畅，筋脉失养。经络是气血运行的路径，在病理因素的影响下，经络不畅，气血运行发生障碍，就会导致各种疾病。活络舒筋药通过通经活络，祛除滞留经络气血运行障碍，治疗经络闭阻，气血运行不畅所致的肌肉、筋骨和关节的疼痛、麻木、屈伸不利等症。这也从实验中得到了印证。

类风湿性关节炎是免疫介导的慢性炎症性疾病，因此多种细胞因子直接或间接介导炎症或组织损伤，IL-2是目前比较有诊断价值的白细胞介素之一，由成熟的T淋巴细胞产生，类风湿性关节炎患者无论是在血液还是在关节液中的IL-2量都明显减少，导致免疫功能调节紊乱[16]。类风湿性关节炎是活性T细胞浸润引起滑膜血管增生及血管翳形成导致关节软骨和骨质的破坏，TNF-α是一种促炎细胞因子，在免疫反应、炎症和对损伤的反应中起重要作用，主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调节，并与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络，在类风湿性关节炎局部炎症细胞因子相互作用网络中起关键作用[17-18]

舒筋活络5味中药通过药物调节骨中的矿物质含量而显著增加大鼠骨密度、抗炎因子 IL-2的水平，降低致炎因子TNF-α的水平，提高机体抗炎，从而促进炎症的减退。

综合5味中药的实验研究结果可知，每味药都有自己的作用特点，有各自的作用侧重点，从不同的作用机制具有改善维甲酸致大鼠骨质疏松的作用及抑制大鼠佐剂性关节炎，基于此研究，认为改善大鼠骨质疏松及抗佐剂关节炎是舒筋活络药的药效谱之一。