深圳大鹏澳海域翡翠贻贝中麻痹性贝类毒素的含量特征及生物相关因子分析

王旭峰，陈海刚，莫梦松，王强，黎智广，赵东豪

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东省渔业生态环境重点开放实验室，农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心，广州 510300)

麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)是一种分布广泛的海洋生物毒素[1]，属于四氢嘌呤衍生物[2]，毒性强烈，中国近海区域的消费者因误食被毒素污染的贝类产品引发严重的中毒或死亡事件时有发生。其毒素作用机理与河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)类似，通过抑制钠离子通道的传输而影响神经的传导，使人体神经系统产生麻痹作用[3-5]。研究证实，PSP来源于有毒赤潮中的产毒藻类，多种亚历山大藻(Alexandrium)、链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)和巴哈马梨甲藻(Pyrodiniumbahamense)等均分泌产生毒素[6-7]。滤食性贝类摄食这些产毒藻类，使PSP在体内蓄积，造成潜在的食用风险。鉴于PSP对于贝类食用安全的危害，美国和欧盟等发达国家和地区都建立了各自相对完善的PSP监测计划、风险预警体系和管控措施。中国相关部门制定了一系列的贝类毒素卫生质量标准和赤潮预警及有毒赤潮应对措施，但是尚未建立起有效的PSP预警体系和风险监测规范[8]。近年来中国沿海区域贝类养殖规模的不断增长，生态环境破坏恶化加剧，海区水体经常严重富营养化，赤潮爆发次数越来越多，沿海区域贝类PSP污染情形越来越多[4-6,9-11]，引起了相关部门的高度重视。

南海海域是国内重要的经济贝类养殖区，人们因食用含毒素贝类导致的食物中毒事件时有发生，已引起广泛关注。江天久等[8]对深圳海域贝类中PSP含量调查表明，染毒贝类的检出率较高，认为南海海域属于PSP的高发区域。冷科明等[6]采用小鼠生物法测定珠江口海域(珠江口、大鹏湾和大亚湾)贝类中的PSP，检出的毒素含量普遍偏低。大鹏澳属于开放性海域，与外海水体交换畅通，适宜经济贝类养殖，其中翡翠贻贝(Pernaviridis)又是易蓄积PSP的双壳贝类。为了调查该海域PSP的污染水平，研究浮游植物潜在产毒藻的种类、丰度变化情况与翡翠贻贝体内PSP含量的相关性，于2017年8月至2018年4月在大鹏澳海域每月定期采集翡翠贻贝和浮游植物样品，测定石房蛤类毒素(saxitoxin，STX)、膝沟藻类毒素(gonyautoxin，GTX)和N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)等13种PSP的含量，鉴定浮游植物的种类和丰度。

目前，文献报道的PSP检测方法主要有小鼠生物法(MBA)[12]、酶联免疫法(ELISA)[13-14]、液相色谱法-荧光法(HPLC-FLD)[15-17]和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)[18-23]等。小鼠生物法作为AOAC推荐的PSP半定量分析方法，是唯一被大多数国家普遍接受和广泛使用的标准方法，具有毒性反应直接、可靠的优点，但无法区分样品中的PSP种类[12]。ELISA法往往缺乏对所有毒素组分特异性强的抗体[13-14, 18]。HPLC-FLD法需要衍生化反应，且难以排除假阳性结果的干扰[15-16, 19]。LC-MS/MS法近年来以定性定量准确的技术优点被应用于PSP的检测。本研究采用石墨化碳黑固相萃取小柱净化提取液，减少样品稀释倍数，经超高效液相色谱分离，11 min内完成样品测定，方法操作简单快速、灵敏可靠。通过研究PSP的含量变化与潜在产毒藻的种类、数量之间的关系，为相关部门完善和强化PSP监测和风险预警提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

在大鹏澳海域设置SZ1、SZ2和SZ3共3个采样点(图1)，从2017年8月至2018年4月，每月中旬同时采集水样、浮游植物和翡翠贻贝等样品。

表层水样：样品瓶预先用纯水冲洗干净，且不与金属器件接触，采样前再用现场海水冲洗2次。将5 L水样，用20 μm的玻璃纤维微孔滤膜(Φ47)抽滤，然后收集滤膜，自然风干后，测定滤膜上固形物中PSP的含量。

浮游植物：按照GB17378.7—2007[24]中规定的方法，用浅水Ⅲ型浮游生物网进行底层至水面的垂直取样。采集(～5 m)浮游植物样品，经中性甲醛溶液固定后，带回实验室鉴定。

翡翠贻贝：挑选大小均一的翡翠贻贝，每个样品不少于500 g，用海水冲洗干净后，放入双层聚乙烯袋中，带回实验室于-18 ℃以下冰冻保存。去壳后，将样品再分为整贝、内脏团和其他可食组织3种样品类型，分别用绞肉机制成肉泥状，备用。

为比较不同贝类对PSP的蓄积能力差异，在设定站位附近也采集了近江牡蛎(Crassostrearivularis)样品。去壳后，处理方法同翡翠贻贝。

图1 贝类采样站位图Fig.1 Sampling stations for shellfish

1.2 仪器与试剂

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(配备Masslynx V4.1控制软件)，购于美国Waters公司；5810台式高速冷冻离心机，购于德国Eppendorf公司；MS3旋涡混合器购于德国IKA公司；去离子水发生器，购于美国Millipore公司；N-EVAP氮吹仪，购于美国Organomation公司。

13种PSP的标准溶液均购于加拿大国家研究委员会(NRC)；甲酸、乙腈及乙酸铵为色谱纯，购于美国Thermo Fisher公司；石墨化碳黑固相萃取柱(250 mg，3 cc)，购于天津博纳艾杰尔科技有限公司；0.22 μm尼龙66注射式滤器，购于天津市津腾实验设备有限公司；20 μm玻璃纤维微孔滤膜，购于英国Whatman公司；试验用水为Milli-Q超纯水；其他未做说明的化学试剂均为分析纯，购于广州市化学试剂厂。

1.3 样品前处理

称取(5.00±0.05) g贝类样品，风干的浮游植物样品同滤膜称重后全部剪碎(去除滤膜的重量)，置于50 mL聚丙烯离心管中，再加入5 mL 2%乙酸水溶液，100 ℃水浴条件下提取10 min，待样品冷却后，8 000 r/min离心5 min。转移上清液至15 mL聚丙烯离心管，待净化。

石墨碳黑固相萃取柱使用前先用3 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液和3 mL 0.1%氨水平衡。准确移取1 mL提取液，加入5 μL氨水混合均匀，上柱，然后用3 mL纯水淋洗小柱，1 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液洗脱。收集洗脱液，用乙腈稀释至2 mL，12 000 r/min高速冷冻离心15 min，吸取上清液过0.22 μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器测定条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃；进样量10 μL；流速0.35 mL/min；流动相为0.1%甲酸乙腈(A)和5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(B)。梯度洗脱程序：0～8.0 min，10%～90% B；8.0～8.5 min，90% B；8.5～9.0 min，90%～10% B；9.0～11 min，10% B。

1.4.2 质谱条件

采用电喷雾电离(ESI)，正、负离子扫描；离子源温度150 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气流量850 L/hr；碰撞气流速0.20 mL/min，锥孔反吹气流量150 L/hr；监测方式为多时段-多反应监测(multiple-period MRM)。

表1 13种PSP的质谱采集参数Tab.1 MRM parameters of 13 PSP

注：带*为定量离子(Quantitative ion)。

2 结果与讨论

2.1 水样及浮游植物中未测出PSP

现场用多参数水质监测仪测定海水的温度、盐度、pH和溶解氧等水质指标。冬季测得的最低水温为11.5 ℃，夏季时最高达31.2 ℃。盐度为30.5～34.1，大鹏澳海域与外海畅通，盐度变化较小，降水较多的月份，盐度会随之降低，大多月份维持在33～34。pH值为7.71～8.03，溶解氧为3.24～11.43 mg/L。水质样品采用固相萃取法处理，未检出PSP，可能是海水中的毒素含量远远低于方法检测限所致。水样用隔膜真空泵经玻璃纤维微孔滤膜抽滤，收集滤膜上的浮游植物，测定PSP含量，所有月份的样品均未检出，结合浮游植物的鉴定结果，可能与产PSP的甲藻丰度太低有关。此外，海水抽滤后获取的浮游植物样品较少，也是浮游植物样品中难以检出PSP含量的另一原因。

2.2 翡翠贻贝样品检测结果

从2017年8月至2018年4月，每月中旬采样1次，共采集翡翠贻贝样品11次，2017年8—11月均未检出毒素。12月由于检出了PSP，在元旦前后加密了翡翠贻贝的采样频次。开壳前，首先测定翡翠贻贝的生物学指标。不同月份翡翠贻贝的生长情况不同，8～12月份采集的翡翠贻贝样品个体较大，壳体最长达8.5 cm;1～2月采集的翡翠贻贝样品较小，长度约3.3 cm，体重为4.5～21.0 g。

2017年12月至2018年3月采集的翡翠贻贝样品，检出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等，共8种PSP，每种毒素的含量为2.12 ～ 354.55 μg/kg，这可能与冬季时该海域的水温比较适宜分泌PSP的有毒藻生长有关。按照国际惯例，STX毒素的毒性因子被设为1，其他各种毒素按照其相对于STX的毒性大小来确定毒性因子(表2)，样品中每种贝类毒素的毒力按照毒性因子，统一转换为STX的毒力当量来表示。将每个样品检出的不同种类PSP含量转换为STX毒力当量，则翡翠贻贝蓄积的PSP的毒力当量为0.93～220.90 μg/kg(PSP的毒力以STX的毒力当量计，全文同)(表3)。

表2 PSP毒性因子[25]Tab.2 Toxicity factors of PSP

表3 大鹏澳翡翠贻贝样品中PSP的检出含量Tab.3 Detected content of PSP in Perna viridis samples in monitor sites of Dapeng Bay n=3

注：“—”示未检出。毒素含量数值以“平均数±标准差”表示。

为比较翡翠贻贝与其他贝类对PSP的富集能力，在采集翡翠贻贝样品时，同时在设定站位附近也采集了近江牡蛎样品。检测结果显示，翡翠贻贝与近江牡蛎蓄积的PSP种类相同，但前者蓄积的毒素含量明显高于后者，说明翡翠贻贝比近江牡蛎更易蓄积PSP。通常情况下，贻贝等双壳贝类对PSP不敏感，藻类毒素对其摄食行为影响较小，其体内容易蓄积较高浓度水平的毒素；相反，牡蛎对PSP高度敏感，当藻类中毒素含量较高时，其会产生减少贝壳开合、选择性滤食等生理反应，以减少毒素的暴露。因此，与贻贝相比，相同环境条件下，牡蛎中PSP的含量往往较低[26]。

为了解贝体中不同部位的毒素含量，将去壳后的每个翡翠贻贝样品，再分为整贝、内脏团和其他可食性组织3种样品类型，分别测定PSP的含量。结果显示，内脏团中PSP含量明显高于贝体其他可食性组织，与其他人的研究结果一致[27-28]，所有检出PSP的样品的PSP的含量从高到低为：内脏团>整贝>其他可食性组织。贻贝为滤食性贝类，其体内的PSP为外源性毒素，通过滤食含毒的藻类而蓄积获得，因此其内脏团中的毒素含量最高。

2.3 浮游植物鉴定结果

实验期间共采集的7次浮游植物样品，按照GB17378.7—2007[24]中规定的方法进行鉴定，优势藻均为中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、柔弱角毛藻(ChaetocerosdebilisCleve)和柔弱菱形藻(Nitzschiadelicatissima)等硅藻，占浮游植物样品总量的90%以上，其他藻类种类少，丰度低。将每月采集的样品，按前六种优势藻出现的频次作图，结果见图2，中肋骨条藻等的出现频次最高，大多数月份均为第一或第二优势藻。

图2 大鹏澳优势藻出现频次(2017年9月—2018年3月)Fig.2 Frequency of dominant algae from Sep, 2017 to Mar, 2018 collected in Dapeng Bay

甲藻检出较多的有具尾鳍藻(Dinophysiscaudata)、夜光藻(Noctilucascintillans)、大角角藻(Ceratiummacroceros)和叉角藻(Ceratiumfurca)等。夜光藻是主要的海洋赤潮发生藻之一，常分布于富营养化的海区，具发光能力，可形成赤潮，对渔业危害很大，但其本身不含毒素，不产生PSP。2017年11月的浮游植物样品，甲藻总量达10%(图3)，但未检测到能分泌产生PSP的亚历山大藻、链状裸甲藻和巴哈马梨甲藻等。

2.4 浮游植物与贝类中PSP的相关性

2017年12月的翡翠贻贝样品检出了GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8种PSP，含量最高为220.90 μg/kg(表3)。2018年1—2月仍从翡翠贻贝中检出多种PSP，但含量迅速降至较低水平(图4)，此时的甲藻数量较少，与之前的月份相当。2018年3月从翡翠贻贝中仅检出了GTX5，毒素含量为0.93～2.09 μg/kg，4月的样品未检出任何PSP组分。上述结果说明，大鹏澳翡翠贻贝体内PSP含量较低，且水体中被证明的能够分泌产生PSP的甲藻数量也太少，故目前的研究结果尚无法揭示产毒藻的数量与贝类体内PSP含量之间的相关性。

此外，具尾鳍藻可产生腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning toxins，DSP)，每月的浮游植物样品均有检出，预示着该海域的贝类可能会蓄积DSP，应当引起人们的注意。

本研究结果表明，大鹏澳翡翠贻贝中检出的PSP种类多，但大多为毒性较低的毒素种类，采集样品中最高毒性当量为220.90 μg/kg，尚未达到欧盟的限量标准800 μg/kg。但结合本实验室多年来对该海域贝类中PSP的监测情况，认为冬季仍有必要加强监测大鹏澳海域贝类中PSP的污染状况。

图3 大鹏澳海域不同月份甲藻占比Fig.3 Proportion of dinoflagellate in different months collected in Dapeng Bay

图4 大鹏澳翡翠贻贝中PSP毒力的时间变化趋势总毒力为该日月中检出的PSP平均值。Fig.4 Change tendency of toxicity of PSP in different monitor months in Dapeng Bay Total toxicicity refers to the average value of detected PSP in mid-month.

3 结论

本研究调查了深圳大鹏澳翡翠贻贝中PSP的污染情况及浮游植物的种类、丰度。从2017年12月至2018年3月的翡翠贻贝样品中共检出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8种毒素，每种毒素的质量浓度为2.12～354.55 μg/kg，各个样品PSP的含量为0.93～220.90 μg/kg。12月份样品中PSP检出种类最多，含量也最高。在浮游植物样品采集期间，该海域的优势藻均为中肋骨条藻、柔弱角毛藻和柔弱菱形藻等硅藻，其他藻类种类少，丰度低。甲藻检出较多的为具尾鳍藻、夜光藻等不产PSP的藻类，而塔玛亚历山大藻等产PSP的甲藻数量太少，且翡翠贻贝体内PSP含量总体较低，因此目前的研究结果尚无法揭示产毒藻的数量与贝类体内PSP含量之间的相关性。样品中检出的PSP种类多，但大多为毒性较低的毒素种类。尽管翡翠贻贝中PSP的含量未达到欧盟的限量标准800 μg/kg，冬季仍需加强监测贝类中PSP含量。